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蓝白筛选在CRISPR/Cas9脱靶效应检测中的应用

王倩  
【摘要】:目的:脱靶效应的评估对核酸酶应用于人类基因治疗中至关重要。本课题运用蓝白筛选技术,建立CRISPR/Cas9剪切效率的原核评估系统,并利用该系统评估PAM位点处碱基突变时对其效率的影响,以及探讨不同个数及位置的碱基突变对CRISPR/Cas9靶效应及脱靶效应的影响。同时,通过白变蓝实验,评价EGFR突变相关gRNA的活性。方法:在探讨PAM位点处对CRISPR/Cas9效率的影响中,分别将PAM位点处碱基突变的靶点克隆至PMD19-T载体的LacZ区,保持原有阅读框编码状态,在X-Gal和IPTG诱导下,上述载体转入E.coli可产生蓝色菌落。通过共转靶点和含对应gRNA的CRISPR载体,观察菌落的颜色变化及结合溶菌实验定量分析CRISPR/Cas9效率。为了在序列水平反映CRISPR/Cas9的效率,构建含HBV双重复片段的载体,将靶点序列插入重复片段之间,使待测靶序列和双重复片段均位于LacZ区内,并使阅读框发生移码突变,但当双重复片段重组后,其阅读框可恢复编码。通过菌落白变蓝的颜色变化以及结合测序技术,验证CRISPR/Cas9的剪切效果。在探讨不同个数及位置的碱基突变对CRISPR/Cas9脱靶效应影响中,分别将含有1-3个且不同位置碱基突变的靶序列克隆至PMD19-T载体的LacZ区,保持其阅读框处于编码状态。利用上述所建立的原核评估体系,通过观察共转后所产生的颜色变化以及溶菌之后蓝白菌落的比例,分别比较了七个突变载体的靶效应及脱靶效应。利用已构建原核系统中的白变蓝方法评估非小细胞肺癌EGFR基因15del突变的相关靶点效率。分别将以NGG,NGA及NAG为PAM位点的靶点序列插入HBV双重复片段载体中。将与这三个靶点配对的gRNA分别插入pCas9载体中。通过共转两种载体,观察所产生的的蓝色菌落数量,对三个靶点的效率进行定量分析,并通过后续的测序结果进一步验证剪切的发生。结果:在探讨PAM位点处碱基突变对CRISPR/Cas9脱靶效应的影响中,当靶序列与gRNA完全配对时,共转后菌落均呈白色;当完全不配对时,共转后菌落则呈蓝色。实验结果表明NAG可作为一种潜在的PAM位点,并仍有一定的酶活性。当对PAM位点进行单碱基突变时,NNG和NGN两类突变靶点剪切效率明显降低;当对PAM位点NGG中的两个碱基G分别进行突变时,CRISPR/Cas9虽仍具有部分剪切活性,但其效率仅剩NGG时的五分之一。由于靶点PAM位点处均含有突变,故此时的剪切活性即为脱靶效应。当含有PAM位点突变靶点的HBV重复片段载体与对应的gRNA共转时,均有蓝色菌落产生,且蓝色菌落的数量与溶菌结果大体一致,测序结果同样也验证了CRISPR/Cas9剪切效应。在探讨不同个数及位置的碱基突变对CRISPR/Cas9脱靶效应的影响中,将含有不同靶点的载体与其对应的gRNA载体共转后,菌落颜色呈现了由白至蓝的梯度变化。突变碱基的个数越多,其菌落的颜色越蓝。后续的溶菌实验也同样表明,突变的碱基个数越多,剪切后的菌落蓝色越深,其剪切效率越低,脱靶效应也越低,即剪切效率与突变碱基个数成负相关。在评估非小细胞肺癌EGFR基因15del突变的相关靶点效率中,NGG型PAM位点与对应的CRISPR/Cas9载体共转后,其产生的蓝色菌落最多,靶效率最高;而在NAG型和NGA型中,靶效率明显下降。比较这两种类型的靶点可发现,NAG型的靶点其剪切效率明显高于NGA型,此实验结果也验证了第一部分的实验结果。结论:本课题以蓝白筛选为基础,构建了CRISPR/Cas9靶效应及脱靶效应的原核评估体系,为快速高效地检测核酸酶活性提供了一种新方法。并成功利用该体系比较了不同碱基突变对CRISPR/Cas9酶活性的影响,以及将该评价体系用于针对EGFR一个热点突变相关gRNA的筛选,为将来在人类疾病的基因治疗中更充分的了解靶点的选择提供了理论依据。


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