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抗菌肽cathelicidins抵御非包膜病毒CVB3复制及病毒性心肌炎的功能和机制研究

黄春景  
【摘要】:抗菌肽(antimicrobial peptides,AMPs)系多物种保守表达的具有天然广谱抗微生物活性的小分子多肽,在哺乳动物分为Defensins和Cathelicidins家族。人和小鼠的cathelicidin分别为LL-37和CRAMP。cathelicidins表达于多种组织细胞(上皮细胞、角质细胞、胰岛细胞)、和免疫细胞(中性粒、巨噬、肥大细胞等),其以无活性前体形式合成,剪除N-端信号肽后成为活性成熟肽。cathelicidins可天然抑制革兰氏阳性和阴性菌、真菌和多种有包膜病毒(呼吸道合胞病毒、流感病毒),其机制为抗菌肽正电荷与微生物带负电荷的膜结构静电吸引并以-螺旋破坏细胞膜完整性导致微生物死亡;还可阻断脂多糖(LPS)与LPS结合蛋白的结合及其炎症作用。Cathelicidins的广谱抗微生物活性使当前国际以哺乳动物抗菌肽cathelicidins为模板开发的肽类抗生素Iseganan、Omiganan成为热点并已进入临床试验阶段。抗菌肽cathelicidins还对免疫细胞和非免疫细胞发挥多样的免疫调节功能,包括趋化中性粒细胞、单核/巨噬细胞、直接激活炎症细胞分泌促炎细胞因子、激活上皮细胞/角质细胞抗病原菌应答等等。抗菌肽cathelicidins是否可作用于自然界的许多非包膜病毒?目前仅有两例报道发现LL-37可体外抑制腺病毒(adenovirus)和鼻病毒(rhinovirus)复制,机制不明,且没有体内研究。cathelicidins是否发挥抗非包膜病毒复制及其相关炎症疾病的作用及机制成为本课题研究的焦点。B3型柯萨奇病毒(coxsackievirus B type 3,CVB3)为微小正链RNA病毒,属于非包膜病毒。CVB3经粪口途径入血感染后继发诱导急性心肌炎和胰腺炎。病毒性心肌炎(viral myocarditis,VMC)是以心肌局灶性或弥漫性炎症为主要特征的临床常见心血管疾病,虽其全球发病率为0.12~12%,但其早期诊断缺如、无治疗手段,使其发病不断上升。VMC进一步进展为扩张型心肌病和心衰,是青少年猝死的主要原因之一。CVB3感染多脏器,其复制于感染第3-4天达到高峰,而后降低水平。这与我们的预实验观察到的CVB3感染小鼠心脏CRAMP表达水平显著上调,峰值在第三天所一致;我们还观察到CVB3感染极早期(1-2天)中性粒细胞在心脏的优先优势浸润,而中性粒细胞报道分泌抗菌肽的重要免疫细胞,提示了CVB3感染心脏早期局部抗菌肽的上调分泌可能对CVB3的复制与致病都发挥抑制和调控作用。基于此,本研究假设:抗菌肽作为免疫细胞和组织细胞释放的天然抗感染小分子,是否在CVB3感染早期的心脏局部显著上调并发挥重要的抗病毒作用和炎症调控作用?因其不能经由静电机制直接破坏病毒包膜,cathelicidin抑制CVB3复制是否通过调控抗病毒免疫等的间接机制?在CVB3感染雄性C57BL/6小鼠诱导的急性VMC小鼠模型中,我们跟踪了各脏器CRAMP的动态表达曲线与CVB3组织复制的关系;通过外源性给予抗菌肽cathelicidins(CRAMP和LL-37)和使用CRAMP敲除小鼠在体内明确了cathelicidins对CVB3复制及其诱导VMC的作用;进一步探索了抗菌肽cathelicidins抵御非包膜病毒CVB3复制和调控局部抗病毒固有免疫的分子机制。第一部分:CVB3感染小鼠显著上调心脏CRAMP的表达一、CVB3腹腔感染小鼠诱导急性心肌炎以1500TCID_(50)剂量的CVB3腹腔注射C57雄鼠,观察0-7天小鼠各指标变化,发现:CVB3感染小鼠的7天生存率约50%;体重减轻率约20-30%;第7天小鼠心脏石蜡切片HE染色证实:相较于正常心肌细胞呈梭形,边缘清晰无炎症浸润;CVB3感染小鼠呈灶性心肌细胞坏死,大量炎症性细胞浸润。心脏和胰腺、肝脏等的病毒复制曲线显示:CVB3各脏器病毒复制均在第3天为峰值,7天已降至本底水平。二、CVB3感染小鼠心脏CRAMP的表达显著增高为检测CRAMP在CVB3感染小鼠各组织器官内的动态表达,取CVB3感染小鼠心脏、小肠、肝脏和脾脏,RT-PCR检测不同时间点各组织内CRAMP表达水平。结果显示:1)CVB3易感脏器内CRAMP的RNA表达水平均显著上调,心脏最为显著;2)ELISA检测CRAMP蛋白水平,亦证实CRAMP蛋白被CVB3显著诱导上调;3)Western blot和IHC检测心脏CRAMP的表达,证实:VMC小鼠心脏内CRAMP显著表达在第3天达到峰值,随后呈下降趋势,在感染第7天仍呈较高水平。第二部分:外源性给予抗菌肽cathelicidins显著抑制CVB3复制及其诱导的心肌炎症损伤一、外源给予抗菌肽cathelicidins显著改善CVB3感染小鼠的生存为明确抗菌肽cathelicidins对CVB3复制及相关疾病的作用,首先采用体内试验,通过外源给予人和小鼠的cathelicidins,研究cathelicidins对CVB3感染小鼠的疾病治疗效果,C57小鼠分别给予PBS、PBS合并CVB3、sCRAMP/sLL-37合并CVB3,CRAMP/LL37合并CVB3,于0天感染CVB3,第0、2、4天腹腔注射10mg/kg剂量的抗菌肽(CRAMP和LL-37)及其同型对照肽(sCRAMP或sLL-37),观察0-7天内小鼠生存情况。结果显示:PBS和同型对照肽处理小鼠与未处理小鼠几近一致,而外源性给予抗菌肽cathelicidins后,小鼠7天生存率显著增加(生存率由50%增加至90%,p0.05),体重减轻率则无显著变化。二、外源给予抗菌肽cathelicidins显著抑制CVB3在心脏的复制病毒感染第3、7天,检测心脏内病毒复制情况,结果显示,外源给予抗菌肽后,第3天心脏中的病毒RNA(+)和RNA(-)水平均显著降低;心脏组织切片的病毒RNA原位杂交确认了病毒RNA水平在CRAMP给予组的显著降低;以western Blot检测心脏CVB3衣壳蛋白VP1的表达,发现CRAMP的给予显著减少了CVB3的主要结构蛋白表达;最后以TCID50检测分析病毒滴度,发现给予CRAMP显著降低病毒滴度(病毒滴度由3*10~6 TCID50减少至0.5*10~(6 )TCID50,p0.01)。提示外源性给予抗菌肽cathelicidins显著抑制非包膜病毒CVB3的复制。三、外源给予CRAMP显著抑制了急性心肌炎的程度为研究CRAMP是否对CVB3感染诱导的组织炎症病理产生小鼠影响,病毒感染第7天分析心脏病理,发现:PBS对照组小鼠心脏呈现多个炎症细胞浸润灶和心肌细胞坏死,CRAMP给予小鼠的心脏炎症细胞浸润显著减轻(病理评分由5降低至3,p0.05);进一步检测小鼠心脏炎性细胞因子表达水平,发现:与PBS及sCRAMP对照组相比,CRAMP处理组小鼠心脏TNFα和IL-1β等(Th1型)水平显著降低,而IL-10(Th2型)表达水平显著增加。表明外源性给予CRAMP显著抑制了非包膜病毒诱导的急性心肌炎症损伤。四、外源给予CRAMP显著改善CVB3感染小鼠心脏功能病毒感染第7天,采用超声诊断仪检测小鼠心脏收缩和舒张功能。结果显示:与正常小鼠相比,CVB3感染的PBS处理小鼠心脏左心室收缩及舒张末期内径显著增大,而左室射血分数及左室短轴缩短率数值显著降低,提示CVB3感染导致小鼠心脏收缩及舒张功能显著减退;与之相比,CRAMP注射小鼠左心室收缩及舒张末期内径显著降低、左室射血分数及左室短轴缩短率数值显著回升,提示给予CRAMP显著改善小鼠的心脏功能,发挥显著治疗作用。第三部分:CRAMP敲除小鼠显著增加对于CVB3感染及心肌炎的易感性一、CRAMP敲除小鼠感染CVB3后生存率显著降低为进一步证实抗菌肽cathelicidins抵御非包膜病毒CVB3复制和病毒性心肌炎的功能,以CRAMP敲除小鼠感染CVB3,检测一系列相关指标,发现与WT组小鼠相比,CRAMP敲除小鼠生存率显著降低、体重减轻率显著增高(P0.05)。二、CRAMP敲除小鼠感染CVB3后病毒复制显著上调检测CRAMP KO小鼠感染第3/7天的心脏、肝脏和脾脏病毒滴度,结果显示:与WT组相比,感染第3天CRAMP敲除小鼠心脏病毒的载量(RNA(+))和复制水平(RNA(-))均显著增加(p0.05),以TCID50试验检测各脏器病毒滴度,也证实CVB3的组织复制滴度显著增加(由0.5*10~(6 )TCID50增至1.8*10~(6 )TCID50/心脏,p0.05)。提示CRAMP显著抑制CVB3的体内复制。三、CRAMP敲除小鼠的VMC发病程度显著增加为明确CRAMP对CVB3诱导的心脏炎症损伤的影响,取感染第7天小鼠心脏行HE染色病理分析。结果显示:与WT组小鼠相比,CRAMP敲除小鼠感染后心脏炎性细胞浸润显著增加,心肌细胞坏死程度显著加剧(病理评分由1.2增加至3,p0.01);同时发现:第7天心脏IL-1β,TNFα等细胞因子水平在CRAMP KO小鼠显著高于WT小鼠。提示CRAMP抗菌肽可显著抑制病毒诱导的心肌炎。四、CRAMP敲除小鼠感染CVB3后心脏功能显著下降感染第7天,以超声诊断仪检测小鼠心脏功能。结果发现:与Sham小鼠相比,WT小鼠感染后心脏收缩及舒张功能显著衰退;与WT相比,CRAMP敲除小鼠的左室射血功能(EF%,数值由60%降至50%,p0.05)衰退更加显著,心脏收缩及舒张间距更加明显(FS%,数值由40%降至30%,p0.05),提示CRAMP敲除加剧了CVB3对小鼠心脏功能的损害,反向证实CRAMP在CVB3诱导的心脏炎症损伤中发挥保护性功能。第四部分:CRAMP抑制CVB3病毒复制和心肌炎的机制探讨抗菌肽cathelicidins抗细菌和包膜病毒的机制均通过正负电荷静电吸引直接破坏脂质包膜实现。而其对非包膜病毒的抑制机制尚未见报道。为此,我们在体外原代心肌细胞研究了CRAMP抗病毒作用及其可能机制;并在体内研究了CRAMP调控抗病毒固有免疫应答的间接机制。一、CRAMP以间接方式抑制CVB3病毒复制体外培养乳鼠原代心肌细胞,CVB3感染同时,CRAMP通过三种方式处理细胞:(1)CRAMP-maint:CVB3(MOI=10)先感染1hr,再加入PBS、CRAMP/sCRAMP、LL-37/sLL-37肽(20μg/ml)。(2)CRAMP-cell-pre:先加PBS、CRAMP/sCRAMP、LL-37/sLL-37肽预处理细胞,再加CVB3(MOI=10)感染1hr。(3)CRAMP-virus-pre,CVB3分别与PBS、CRAMP/sCRAMP、LL-37、s LL-37肽混合孵育1hr,再加入细胞。检测原代心肌细胞病毒复制发现:无论是病毒RNA还是CVB3衣壳蛋白VP1表达均提示:抗菌肽与病毒共孵育后(3)再加至细胞不能改变病毒的感染与复制,提示抗菌肽不能直接抗病毒;而先以抗菌肽处理细胞再以CVB3感染(2)也不能影响病毒的复制;仅在感染CVB3后的心肌细胞再加入CRAMP或LL-37(1)能够显著抑制病毒复制,提示CRAMP不能直接作用于非包膜病毒CVB3,而是在CVB3感染心肌细胞后,以某种特别的间接方式抑制已成功感染病毒的胞内复制。二、外源性给予CRAMP和LL-37显著抑制CVB3受体CAR的表达CVB3感染后加入抗菌肽,检测心肌细胞表面CAR的表达,结果显示:CVB3感染心肌细胞略微下调CAR受体的表达,而与之相比,抗菌肽(CRAMP或LL37)显著性减少CAR蛋白水平(90%,p0.01),作用50min后CAR表达几乎消失。提示抗菌肽通过显著下调心肌细胞表面的CAR抑制CVB3复制。三、小鼠给予CRAMP显著降低CVB3感染外周血髓系免疫细胞数目为了探究CRAMP是否通过调节小鼠抗病毒固有免疫而实现抗CVB3效应,在CVB3感染同时,小鼠注射CRAMP和LL37,跟踪监测了抗菌肽对于外周血和心脏内固有免疫髓系细胞(单核、中性粒、巨噬细胞)比例和绝对数的影响,结果发现:1)首先,CVB3感染WT小鼠第3、7天,均显著降低淋巴细胞(CD11b-CD45+)比例和数目、增加髓系细胞(CD11b+CD45+)比例及数目,提示CVB3显著裂解了小鼠外周血和脏期内T细胞,导致淋巴系减少和髓系增多;其中,第3天的中性粒细胞增高及淋巴系降低最为显著,提示为病毒复制高峰;2)与之相比,外周给予抗菌肽,第3天和第7天外周血的髓系细胞比例绝对数显著降低(day3,81%降至26%,p0.05),而淋巴系比例绝对数显著增加(day3,18%降至73%,p0.05),提示小鼠被裂解的淋巴减少状态显著回复。3)外周血髓系细胞中,中性粒细胞比例及绝对数在抗菌肽处理后显著降低(day3,76.2%降至17.7%,p0.05);炎症单核细胞数目也显著降低。因此,CRAMP治疗显著减少外周血髓系免疫细胞富集(特别是中性粒和单核细胞),可显著减少向心脏组织的富集,或为CRAMP减轻心肌炎的原因之一。四、CRAMP给予小鼠感染CVB3后心脏髓系细胞和T细胞浸润显著减少CVB3急性心肌炎(7-10天)的心脏炎症浸润以T细胞和巨噬细胞为主要浸润细胞。为探究CRAMP给予之后是否影响外周血及心脏内T淋巴细胞的变化,检测了感染第7天外周血和心脏内CD3+/CD4/及CD8+T细胞比例及绝对数的变化,结果显示:1)CRAMP的给予不影响外周血T淋巴细胞及其亚群比例及数量;2)CRAMP显著降低第3天小鼠心脏CD45+总淋巴细胞(20%至12%,p0.05)、CD11b+髓系(81%至60%,p0.05;特别是中性粒细胞由19%降至7%;Ly6C炎症单核细胞由14%降至4%,p0.05);因髓系细胞浸润显著减少心脏CD3+T比例由第3天的16%显著回复至28%,T总绝对数无变化而心脏CD8+T浸润显著降低;感染第7天类似。提示CRAMP可显著抑制CVB3诱导的心脏总淋巴细胞和髓系细胞大量浸润。五、CRAMP显著增加CVB3感染后外周血及肠系膜淋巴结内DC数目DC是提呈抗原、激活抗病毒T细胞应答的关键细胞,流式细胞术检测外周血和肠系膜淋巴结(MLN)内DC变化,发现CRAMP显著增加了感染第3天外周血和MLN内CD11c+MHC II~(high) DC细胞的绝对数。提示CRAMP显著上调CVB3感染后外周血和MLN内DC总数,可发挥更有效激活T细胞抗病毒作用。综上,本试验首次在小鼠体内和体外原代心肌细胞试验中,探索了进化保守的抗感染小分子多肽--cathelicidins(CRAMP和LL-37)对于非包膜RNA病毒-CVB3的抑制作用及对CVB3诱导的急性心急炎症损伤的作用。我们首次证实:cathelicidins(CRAMP和LL-37)具有显著抑制非包膜病毒-CVB3的抗病毒作用,但其机制与显著下调心肌细胞表面共受体CAR的间接机制相关;使用CRAMP敲除小鼠和外源注射抗菌肽,我们确证了cathelicidins体内可显著抑制CVB3复制及其诱导VMC的保护作用;这一体内保护作用与抗菌肽cathelicidins抗病毒复制、显著下调外周血炎症髓系细胞向心脏富集浸润、显著下调心脏T细胞浸润密切相关。有关cathelicidins抗菌肽对非包膜病毒的抑制作用及其机制为首次报道,丰富了抗菌肽的靶病毒谱系,并以新的角度解析了心脏固有抗菌肽抑制非包膜病毒复制和调节炎症免疫损伤的机制。


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