体外构建三维细胞培养支架及其在肿瘤化疗药物筛选中的应用研究

【摘要】：【目的】以天然丝素蛋白(SF)和壳聚糖(CS)为主要原料,采用真空冷冻干燥的方法制备经不同生物交联剂交联的两种SF/CS三维细胞培养支架,分别检测其理化性质及细胞相容性试验,筛选出适宜肿瘤细胞生长的三维培养支架。并以此为材料进行肿瘤化疗药物敏感性试验,为肿瘤化疗药物的体外敏感性筛选提供新的技术平台。【方法】第一部分:1.将一定量的清洁蚕茧经过脱胶,干燥,溶解,过滤,透析处理后得到2%~3%的丝素蛋白溶液,将其与3%的壳聚糖溶液以1:1比例均匀混合,加入不同的生物交联剂即三聚磷酸钠(TPP)或碳二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺(EDC/NHS)通过真空冷冻干燥获得两种三维细胞培养支架即EDC交联的SF/CS三维支架和TPP交联的SF/CS三维细支架(EDC组、TPP组)。2.用真空冷冻干燥方法制备纯丝素蛋白(纯SF组)、纯壳聚糖支架材料即(纯CS组)。3.通过光镜、扫描电镜(SEM)、HE染色观察三维支架的形态学特点。4.利用傅里叶变换衰减全反射红外光谱法(ART-FTIR)分析其官能团组成。5.利用X射线衍射(XRD)分析其基本组成。6.检测EDC组、TPP组三维支架的吸水率和溶胀率。第二部分:1.利用SEM观察结直肠癌细胞CT26在EDC组、TPP组三维细胞培养支架中的生长情况。2.采用MTT实验分别检测二维培养(2D)、三维培养(EDC组、TPP组)环境中CT26细胞的增殖能力。3.构建裸鼠移植瘤模型以提取肿瘤组织提取液(TLTT)并采用MTT实验检测不同浓度的肿瘤组织提取液对CT26细胞增殖能力的影响。4.采用DAPI荧光染色检测有肿瘤组织提取液刺激时三维细胞培养支架(EDC组、TPP组)中CT26细胞的凋亡情况。第三部分:1.采用六种常见肿瘤化疗药物(氟尿嘧啶、奥沙利铂、紫杉醇、伊立替康、甲氨蝶呤、卡培他滨)并设置五种药物浓度(0.01μM、0.1μM、1μM、10μM、100μM),分别刺激生长在2D、EDC组三维细胞培养支架(3D、3D+TLTT)中的结肠癌Lovo细胞株、乳腺癌MDA-MB-231细胞株,应用CCK-8实验检测肿瘤细胞对不同种类不同浓度的肿瘤化疗药物的敏感性。【结果】第一部分:1.EDC组比TPP组、纯SF组、纯CS组形成孔隙大小更均一,且排列相对规则,大部分为均质稳定的空隙结构。2.ART-FTIR结果显示交联后的SF/CS三维细胞培养支架中未出现新的特征峰,在此过程中并未形成新的化学键,而是单纯的物理结合。3.XRD结果显示经EDC或TPP交联的SF/CS三维支架结晶程度较纯丝素蛋白发生变化,表现为壳聚糖的结晶形式。4.EDC组SF/CS三维支架的吸水率和溶胀率均明显高于TPP组SF/CS三维支架。第二部分:1.扫描电镜结果显示:EDC组三维支架比TPP组更有利于CT26细胞的粘附、生长和增殖。2.CT26细胞在三维培养支架(EDC组、TPP组)中的增殖能力明显高于二维培养环境(2D),且生长在EDC组三维细胞培养支架的CT26细胞的增殖能力明显比TPP组高。3.瘤组织提取液能在一定程度上促进CT26细胞的增长,且10%肿瘤组织提取液更有利于三维细胞培养模型的CT26细胞的生长与增殖。4.DAPI荧光染色结果显示在相同肿瘤组织提取液刺激时EDC组中的CT26细胞生长状况优于TPP组。第三部分:二维与三维培养环境中肿瘤细胞的化疗敏感性相比有明显差异,且三维培养环境中肿瘤细胞对低浓度的化疗药物具有较高的敏感性。【结论】EDC交联的SF/CS三维支架相比TPP交联的SF/CS三维支架更适合于肿瘤细胞生长,且适宜浓度的肿瘤组织提取液能促进肿瘤细胞生长增殖,EDC交联的SF/CS三维细胞培养支架用于体外肿瘤化疗药物筛选试验与传统二维细胞培养环境下化疗药物敏感性结果相比,肿瘤细胞在三维支架培养环境中对低剂量化疗药物敏感性增加。