橄榄苦苷降低大鼠脑出血模型血脑屏障通透性的机制探讨

【摘要】：第一部分橄榄苦昔抑制氧化应激反应减轻大鼠ICH模型病灶周围BBB的破坏目的测定大鼠脑出血模型mNSS评分、脑组织含水量、血脑屏障通透性、氧化应激相关指标、紧密连接相关蛋白ZO-1、Occludin的表达以及ERK、p38、JNK蛋白的表达,从而评估橄榄苦昔能否通过抑制氧化应激反应减轻脑出血所致的血脑屏障破坏;评估MAPK(ERK、p38、JNK)通路是否与脑出血氧化应激导致血脑屏障破坏相关。方法采用经典的胶原酶Ⅶ建立大鼠ICH模型,假手术组用等量的生理盐水代替胶原酶Ⅶ,实验分为假手术组、脑出血+生理盐水组,脑出血+橄榄苦昔(20mg/kg、40mg/kg、60mg/kg、80mg/kg)组共6组,每组8只。假手术组正常喂养3天,脑出血+生理盐水组,造模成功后20min,皮下注射生理盐水1ml,每天1次,连续3天;脑出血+橄榄苦昔(20mg/kg、40mg/kg、60mg/kg、80mg/kg)组造模成功后20min,用生理盐水分别将(20mg/kg、40mg/kg、60mg/kg、80mg/kg)的橄榄苦昔稀释至1ml后皮下注射,每天1次,连续3天。脑出血模型制作成功后72小时采用mNSS评分进行大鼠行为学测定,大鼠行为学测定完20分钟后处死。采用干湿重法测定脑组织的含水量,伊文思蓝法测定血脑屏障通透性,分光光度计法检测氧化应激指标,Western blot和Real-time PCR 测定大鼠脑组织 ZO-1、Occludin 的含量,Western blot 测定 ERK、p38、JNK蛋白的表达。结果ICH模型组大鼠mNSS评分、脑组织含水量、血脑屏障通透性明显高于假手术组,氧化应激指标(ROS、MDA)以及MAPK下游基因ERK、P38、JNK表达明显增高,抗氧化指标(SOD、GSH-Px),ZO-1、Occludin表达显著降低。橄榄苦昔20mg/kg对大鼠ICH模型所有观察指标无明显影响;而橄榄苦昔40mg/kg、60mg/kg、80mg/kg显著降低大鼠ICH模型的mNSS评分、脑组织含水量、血脑屏障通透性、氧化应激指标(ROS、MDA)及ERK、p38、JNK的表达,显著增加大鼠ICH模型抗氧化指标(SOD、GSH-Px),ZO-1、Occludin的表达,且随着治疗剂量增加而疗效更显著。结论1橄榄苦昔可抑制氧化应激反应减轻大鼠ICH模型病灶周围BBB的破坏从而减轻继发性脑损伤,其作用在一定范围内随着剂量增加而增大;2大鼠ICH模型中,病灶周围脑组织的ERK、p38、JNK的表达增加,氧化应激反应增强,橄榄苦昔抑制氧化应激反应从而下调ERK、p38、JNK的表达。第二部分氧化应激反应增加大鼠ICH模型BBB通透性的可能机制目的通过调控大鼠ICH模型ERK、p38、JNK的功能,观察各组大鼠mNSS评分、脑组织含水量、BBB通透性、氧化应激反应指标、紧密连接相关蛋白ZO-1、Occludin的表达,探讨MAPK(ERK、p38、JNK)通路是否为氧化应激反应导致BBB破坏的主要途径。方法建立胶原酶Ⅶ大鼠ICH模型,假手术组脑内注入等量的生理盐水代替胶原酶Ⅶ,实验分为假手术组、模型对照组、ERK阻断组、p38阻断组、JNK阻断组、联合阻断1组、联合阻断2组、ERK激动组、p38激动组、JNK激动组、联合激动1组、联合激动2组,共计12组,每组8只。假手术组正常喂养3天;脑出血+生理盐水组,造模成功后20min,皮下注射生理盐水1 ml,每天1次,连续3天;各阻断组于造模成功后20min,生理盐水稀释相应阻断剂0.1 ul至1 ml皮下注射,每天1次,连续3天;各激动组于造模成功后20min,生理盐水稀释相应激动剂0.1ul至1ml皮下注射,每天1次,连续3天。脑出血模型制作成功后72小时采用mNSS评分进行大鼠行为学测定,行为学测定完成20分钟后处死大鼠。采用干湿重发测定脑组织的含水量,伊文思蓝法测定BBB 通过性,Western blot 和 Real-time PCR 测定 ZO-1、Occludin 的表达。结果与假手术组比较,ICH模型组大鼠mNSS评分、脑组织含水量、BBB通透性明显增加,而ZO-1、Occludin表达明显降低。与模型对照组比较,ERK阻断组、p38阻断组、JNK阻断组、联合阻断1组、联合阻断2组大鼠mNSS评分、脑组织含水量、BBB通透性较模型对照组显著降低,ZO-1、Occludin表达显著增高,且联合阻断组的作用明显强于单个阻断组,联合阻断2组强于联合阻断1组;ERK激动组、p38激动组、JNK激动组、联合激动1组、联合激动2组大鼠mNSS评分、脑组织的含水量、BBB通透性增高,ZO-1、Occludin表达明显降低,且联合激动剂1组的作用强于单个激动剂组,联合激动2组的作用强于联合激动1组。结论1 ERK、p38、JNK阻断剂能降低大鼠ICH模型病灶周围脑组织的BBB通透性且有协同作用;2 ERK、p38、JNK激动剂能加重大鼠ICH模型病灶周围脑组织的BBB通透性且有协同作用;3.MAPK(ERK、p38、JNK)在大鼠ICH模型氧化应激反应所致BBB破坏的过程中发挥重要作用。