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高尔基体膜蛋白GOLM1和迁移侵袭抑制蛋白MIIP在前列腺癌中的作用与分子机制研究

颜广  
【摘要】:研究背景前列腺癌(Prostate carcinoma,PCa)是欧美国家男性最常见的恶性肿瘤,其死亡率位居第二。最新研究资料显示美国每年新增PCa病例高达220000例,近30000的PCa病人死亡。我国PCa的发病率虽低于西方国家,但由于生活方式的渐进西化和人口老龄化的加剧,近10年来PCa的发病率呈直线上升的态势。目前应用于PCa早期临床诊断的分子标志物主要是前列腺特异抗原(Prostate-specific antigen,PSA),常作为PCa早期筛查的重要检测指标,但其缺点一是特异性不高,在前列腺炎和前列腺增生等良性疾病中也会出现异常增高;二是PSA无法识别PCa的肿瘤类型;三是PCa临床发生滞后于PSA的表达,故目前基于PSA的PCa筛查和诊断尚存有较大的争议。雄激素剥夺治疗(androgen deprivation therapy,ADT)是治疗PCa的主要方法之一,但大多数PCa病人尤其是发生转移的Gleason评分较高的PCa,都会进展为去势抵抗性前列腺癌(castration-resistant prostate cancer,CRPC)。CRPC是前列腺癌进展的最终阶段,在现有的医疗条件下,生存期一般小于2年,是导致PCa病人死亡的主要原因。PCa发生和进展是一个由多基因和多条信号通路参与的一个复杂的调控过程,因此阐明PCa进展的分子机制,寻找新的分子诊断标记物和信号分子治疗靶点,已成为当前的研究热点。PI3K-AKT-mTOR信号通路在多种恶性肿瘤的发生过程中起着关键作用,它的异常激活与PCa进展和治疗耐药有着极其密切的关系,大约42%的原发性PCa和100%转移性PCa存在PI3K-AKT-mTOR信号通路的基因改变。在PCa中PI3K-AKT-mTOR信号通路中的多种组份存在着畸变,包括突变、表达式的变化和拷贝数的更改,些畸变会导致PI3K-AKT-mTOR信号通路的异常激活,PI3K-AKT-mTOR信号通路的异常激活是促进PCa进展的重要原因。因此,阐明PI3K-AKT-mTOR信号通路在PCa进展中的调控分子机制是目前研究的重要方向,PI3K-AKT-mTOR信号通路的抑制剂将有可能成为治疗PCa尤其是高级别的CRPC的新型化疗药物。高尔基体膜蛋白(Golgi membrane protein 1,GOLM1)是一种在PCa中高度表达的分子标志物,但其在PCa中的生物学功能和分子调控机制仍不清楚。其后相继在肝细胞癌和食管鳞状细胞癌中也发现有GOLM1的表达异常。迄今为止对GOLM1的功能学的研究较少,GOLM1可通过调控c AMP响应元件结合蛋白CREB的转录激活,上调MMP13的表达,促进肝细胞性肝癌的肿瘤细胞的浸润。GOLM1还参与了EGFR/RTK再循环,促进肝癌细胞的增殖和转移。介于GOLM1在PCa中的作用和分子机制尚不清楚,第一部分将从PCa标本组织学、PCa细胞水平和PCa动物模型三个层面,系统的研究GOLM1在PCa进展中的生物学功能和分子调控机制,尤其对PI3K-AKT-mTOR信号通路的调控。迁移侵袭抑制蛋白MIIP(migration and invasion inhibitory protein)是一个新发现的抑癌基因,其在胶质瘤、肺癌和结肠癌等肿瘤组织中表达明显低于正常组织,且与预后成负相关。MIIP可通过与IGFBP-2、HDAC6和Cdc20等不同分子结合,调控多个重要的细胞内过程,从而在多种肿瘤中发挥抑癌基因功能。MIIP基因位于染色体1p36区域,研究发现在40%的PCa中发现该区域的缺失,我们推测MIIP可能作为一个抑癌基因在PCa进展发挥抑制作用。但MIIP在PCa中的作用机制与调控模式并不十分清楚,第二部分主要研究MIIP在PCa中的抑癌功能;阐明MIIP与AR通路和PI3K-AKT-mTOR通路的调控关系;同时结合临床样本分析MIIP的表达水平与PCa临床分期和预后的关系。第一部分高尔基体膜蛋白GOLM1在前列腺癌中的作用和分子机制研究1.目的本部分研究旨在阐明GOLM1与PCa病人临床分期的关系;其在前列腺癌细胞系和动物体内的促癌功能;以及其在前列腺癌进展过程中的分子调控机制。2.方法通过检测PCa组织芯片和病人样本中GOLM1的表达水平确定GOLM1与PCa临床分期的关系;通过si RNA干扰和构建GOLM1过表达稳转细胞系,检测在GOLM1敲低或过表达后,PCa细胞功能学以及PCa相关调控通路的变化;通过构建GOLM1过表达的荷瘤鼠模型,检测GOLM1在体内成瘤过程中的作用。3.结果(1)GOLM1在PCa组织中的表达水平高度上调,且在不同临床分期中无明显差异。PCa组织芯片分析显示GOLM1在Gleason分值3、4和5的病理组织中无明显差异,均持续高表达;PCa组织中GOLM1的m RNA和蛋白水平都表达上调。(2)GOLM1具有促进PCa细胞增殖、迁移和侵袭,抑制其凋亡的生物学功能。GOLM1稳定过表达的PCa细胞株GOLM1-DU145和GOLM1-PC3中,细胞增殖、迁移和侵袭能力增强,细胞凋亡减少;GOLM1沉默的条件下,PCa细胞DU145和CWR22Rv1的细胞增殖、迁移和侵袭能力下降,细胞凋亡增加。(3)GOLM1可以激活PI3K-AKT-mTOR信号通路。GOLM1过表达细胞株GOLM1-DU145和GOLM1-PC3中,总AKT和mTOR表达水平与对照组相同,但PI3K(p110)、p-AKT(Ser473)、p-mTOR(Ser2448)和p-mTOR(Ser2481)的与对照组相比表达水平上调;在GOLM1沉默的PCa细胞DU145和CWR22Rv1中,总AKT和mTOR表达水平与对照组相同,但PI3K(p110)、p-AKT(Ser473)、p-mTOR(Ser2448)和p-mTOR(Ser2481)的与对照组相比表达水平下调。(4)GOLM1促进PCa荷瘤鼠模型中瘤体的生长。PCa荷瘤鼠模型中,GOLM1过表达组瘤体生长速度更快,肿瘤体积和质量更大,Ki-67染色结果GOLM1促进体内PCa细胞增殖;TUNEL染色结果GOLM1抑制体内PCa细胞凋亡。(5)GOLM1通过激活PI3K-AKT-mTOR信号通路发挥促癌作用。PI3K抑制剂BKM120可以阻断GOLM1在PCa细胞中的促增殖、迁移和侵袭能力,以及抗凋亡功能。4.结论GOLM1是一个在PCa各个临床分期中均持续高表达的癌基因;细胞实验和动物实验均证实GOLM1具有强大的促癌功能,不仅可以促进PCa细胞的增殖、迁移和侵袭,同时还抑制其凋亡;GOLM1主要通过激活PI3K-AKT-mTOR信号通路促进PCa的进展;GOLM1不仅可以作为PCa早期诊断和指导临床用药的分子标志物,还有希望成为PCa的一个潜在分子治疗靶点。第二部分迁移侵袭抑制蛋白MIIP在前列腺癌中的作用和分子机制研究1.目的本研究将重点开展MIIP在PCa中的增殖抑制功能及其调控机制;阐明MIIP与AR信号通路和PI3K-AKT-mTOR信号通路的调控关系;同时结合临床样本分析MIIP的表达水平与PCa临床分期和预后的关系。2.方法构建MIIP稳定过表达的PCa细胞稳转系,细胞水平检测MIIP的生物学功能;利用实时荧光定量PCR和Western blot技术检测MIIP过表达对AR信号通路或PI3K-AKT-mTOR信号通路的影响;利用Co-IP和免疫荧光共定位技术检测与MIIP相互作用的关键调控分子;构建MIIP过表达的荷瘤鼠模型,检测MIIP在体内抑制肿瘤增殖的作用;利用PCa病人组织芯片分析MIIP表达水平与PCa临床分期的相关性。3.结果(1)MIIP可抑制PCa细胞的增殖。MIIP稳定过表达的AR~+的PCa细胞株MIIP-LNCa P和AR~+的CRPC细胞株MIIP-C4-2中,CCK8增殖检测和平板克隆形成实验都揭示MIIP具有抑制PCa细胞增殖的功能。(2)MIIP不参与AR信号的转录激活和核转位调控。雄激素二氢睾酮处理后,MIIP-LNCa P细胞和对照组细胞一样,AR的靶基因PSA和TMPRSS2的表达都显著增加,且成一定程度的剂量依赖;AR受体拮抗剂恩扎鲁胺处理后,MIIP-LNCa P和MIIP-C4-2与对照组细胞一样,AR的靶基因PSA的表达都显著被抑制,且成一定程度的剂量依赖;恩扎鲁胺处理后AR在MIIP-LNCa P和对照组细胞中都有明显的核转位抑制。(3)MIIP过表达后AKT-mTOR信号通路下调。MIIP过表达PCa细胞系MIIP-LNCa P和MIIP-C4-2中,p-AKT(Ser473)、p-AKT(Thr308)、p-mTOR(Ser2448)和p-mTOR(Ser2481)表达减少,但AKT和mTOR总体表达以及上游的PI3K(p110)的表达并未发生变化。PI3K抑制剂BKM120处理MIIP过表达PCa细胞系MIIP-C4-2和MIIP-PC3 24h,p-AKT(Ser473)、p-AKT(Thr308)、p-mTOR(Ser2448)和p-mTOR(Ser2481)的表达水平与对照组相比下降更明显。(4)MIIP与Ser/Thr磷酸酶PP1α存在相互作用,两者在细胞质中尤其内质网区域存在共定位。MIIP过表达PCa细胞系MIIP-LNCa P和MIIP-PC3中PP1α的表达水平并未发生变化。但免疫共沉淀实验结果显示,MIIP和外源性以及内源性的PP1都存在相互作用。Hela细胞和LNCa P细胞质中,荧光共定位显示,MIIP和PP1α在细胞质中尤其在内质网区域存在广泛的共定位。(5)PP1α沉默后可以回复MIIP过表达引起的AKT-mTOR信号通路下调和细胞增殖抑制功能。PP1α沉默后,MIIP过表达导致的p-AKT(Ser473)和p-AKT(Thr308)表达水平下调可以得到回复;PP1α沉默后可以回复MIIP过表达引起的PCa细胞增殖抑制。(6)MIIP可抑制PCa荷瘤鼠模型中瘤体的生长。MIIP-C4-2和MIIP-PC3 PCa荷瘤鼠模型,通过肿瘤生长曲线绘制,瘤体重量检测,实验结果显示MIIP表达组肿瘤生长速度更快,肿瘤体积和重量更小。Ki-67染色结果MIIP抑制体内PCa细胞增殖。(7)MIIP的表达水平与PCa临床分期成反相关。Gleason分值3、4、5的PCa组织中,MIIP的表达水平随着Gleason分值的增加而逐渐下降。4.结论迁移侵袭抑制蛋白MIIP具有抑制PCa细胞增殖的功能;MIIP并不参与AR的转录激活和核转位;MIIP可与磷酸酶PP1α发生相互作用,抑制AKT的磷酸化水平,AKT-mTOR信号通路下调,从而发挥细胞增殖抑制功能;MIIP的表达水平与临床分期的恶性度成反相关,可以作为一个判断PCa预后的分子标志物和潜在的分子治疗靶点。总之,本论文系统研究了新分子高尔基体膜蛋白GOLM1和迁移侵袭抑制蛋白MIIP在PCa中的生物学功能和分子调控机制。发现GOLM1和MIIP分别在不同层面参与PI3K-AKT-mTOR信号通路的调控,进而导致其异常激活促进PCa的进展。GOLM1可以从上游激活PI3K-AKT-mTOR信号通路,在PCa的进展中发挥促癌功能;MIIP通过与磷酸酶PP1α发生相互作用,抑制AKT的磷酸化水平,导致AKT-mTOR信号通路下调,从而在PCa的进展中发挥抑癌功能。


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