收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

Nrf2信号通路在急性移植物抗宿主病中的作用及机制研究

韩晶晶  
【摘要】:第一部分:靶向激活Nrf2信号通路在a GVHD中的作用研究目的:研究激活Nrf2信号通路在a GVHD发生发展中的作用。方法:建立小鼠同基因造血干细胞移植(sys-HSCT)和异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)后小鼠a GVHD模型,在移植后7天获取小鼠靶器官脾脏、肝脏、肺脏和小肠组织,抽提RNA,采用荧光定量PCR法检测各靶器官中的Nrf2的表达水平,比较同基因/异基因HSCT对Nrf2的影响。采用C57BL/6(H-2b)小鼠脾脏淋巴细胞作为效应细胞,采用辐照的BALB/c(H-2d)小鼠骨髓来源DCs作为刺激细胞,体外建立混合淋巴细胞反应体系,通过加入不同浓度的Nrf2激动剂富马酸二甲酯(DMF),采用~~3H-Td R掺入法、CFSE标记法和ANNEXINV/PI法,检测T细胞的增殖、凋亡情况。ELISA检测上清中细胞因子IL-2、IL-6、IFN-γ和TNF-α的水平。研究DMF激活Nrf2后对异基因反应性T细胞增殖、凋亡和活化的影响。体外采用anti-CD3/CD28刺激T细胞活化,然后加入不同浓度的DMF,采用~3H-Td R掺入法研究DMF对非特异性T细胞激活后的增殖情况。体外采用GM-CSF联合IL-4法从小鼠骨髓中诱导DCs,然后加入不同浓度的DMF或LPS,流式检测DCs表面CD80、CD86和CD40的表达水平,ELISA检测上清中IL-6和IFN-γ和TNF-α的水平,研究DMF对DCs活化和成熟的影响。采用C57BL/6(H-2~b)小鼠作为供体,采用BALB/c(H-2~d)小鼠作为受体。受体小鼠接受清髓性预处理(全身照射8.5Gy),通过输注1×10~7骨髓细胞+5×10~6脾脏细胞建立小鼠a GVHD模型。于预处理前3天予DMF灌胃(30mg/kg/d),连续给药7天。移植后每天两次观察小鼠生存状态,每3天进行a GVHD临床评估。4周后收集小鼠肝脏、肺、肠和皮肤行HE染色并进行病理组织学分析。研究体内激活Nrf2后对小鼠a GVHD的影响。结果:(1)荧光定量PCR结果显示,和syn-HSCT相比,allo-HSCT 7天后小鼠靶器官脾脏、肝脏、肺脏和小肠组织中的Nrf2的表达水平显著降低,提示allo-HSCT后小鼠Nrf2抗氧化通路明显下调,该通路的减弱提示allo-HSCT小鼠体内氧化应激活性增高。(2)体外混合淋巴细胞反应结果表明,DMF能够以剂量依赖的方式抑制同种异基因反应性T细胞的增殖,CFSE标记实验表明CD4+T细胞和CD8+T细胞的增殖均受到明显抑制;此外,细胞培养上清中的炎症因子IL-2、IL-6、IFN-γ、TNF-α也呈显著降低,且呈剂量依赖性,表明DMF能够抑制异基因反应性T细胞的增殖和活化。细胞凋亡实验表明,DMF能够促进异基因反应性CD4+T细胞和CD8+T细胞的凋亡;更重要的是,发生凋亡的细胞主要是CFSE~(low)的一群具有高增殖活性的细胞群体。(3)体外使用CD3/CD28刺激T细胞的实验表明,DMF也能够直接以剂量依赖的方式抑制T细胞的增殖。(4)DMF对DCs的成熟没有明显的促进作用,但是当DCs预先被LPS活化后,DMF能够以剂量依赖的方式抑制DCs表面CD80,CD86和CD40的表达,同时还能抑制IL-6和TNF-α等细胞因子的分泌,表明DMF对已经成熟DCs的活化具有抑制作用。(5)动物实验表明,在移植后早期应该DMF干预能够显著延长a GVHD小鼠的生存,减轻a GVHD的症状,HE病理分析也表明DMF干预后组受鼠的a GVHD靶器官肝,肺,肠和皮肤的病理损害较对照组显著减轻,表明DMF能够改善小鼠的a GVHD症状,抑制a GVHD的发生发展。结论:allo-HSCT后小鼠Nrf2抗氧化通路明显下调,使用DMF激活Nrf2能够抑制T细胞的增殖和细胞因子的分泌,抑制DCs的活化和IL-6和TNF-α的表达。体内使用DMF干预可以显著延长a GVHD小鼠的生存,减轻a GVHD的症状,抑制a GVHD的发生发展。第二部分:靶向激活Nrf2信号通路减弱a GVHD的机制研究目的:研究靶向激活Nrf2信号通路减弱小鼠a GVHD的免疫学机制。方法:分离allo-HSCT后14天的DMF干预组和对照组受体小鼠脾脏细胞,和经照射的BALB/c小鼠脾细胞进行共同培养,建立Ex-Vivo的混合淋巴细胞反应,通过~3H-Td R检测细胞增殖情况。采用流式细胞术检测移植后14d时DMF干预组和对照组小鼠脾脏中的CD3+T、CD4+T、CD8+T细胞,活化的CD4(CD4+CD69+)、CD8细胞(CD8+CD69+)的比例,体外使用PMA/Ionomycin/BFA激活检测CD4+T细胞和CD8+T细胞分泌细胞因子IFN-γ的情况,采用ELISA法检测移植后14d两组小鼠血清中IL-6、IFN-γ和TNF-α的水平。采用磁珠法分选小鼠脾脏中的CD3+T细胞,体外采用anti-CD3/CD28抗体激活T细胞,然后使用不同浓度的DMF处理,24h后检测T细胞活化分子CD69、CD25、CD44以及PD-1的表达水平,研究DMF对T细胞体外活化的影响。采用活性氧Reactive Oxygen Species Assay Kit检测试剂盒,检测DMF处理后T细胞中ROS的表达水平,研究DMF对T细胞氧化水平的影响。抽提移植后14d两组小鼠脾脏RNA,逆转录成c DNA,采用荧光定量PCR法检测抗氧化通路分子Nrf2,keap 1以及抗氧化防御酶HO-1和GST-α1的m RNA表达水平。采用免疫荧光法检测DMF处理后T细胞内Nrf2的入核情况。结果:(1)Ex-Vivo混合淋巴细胞实验表明,DMF能够显著抑制体内异基因反应性T细胞的增殖。(2)流式细胞术检测表明,移植后14d时,和对照组相比,DMF干预组小鼠脾脏中的CD3+T、CD4+T细胞的百分比显著降低,而CD8+T细胞则明显升高。DMF干预的受体小鼠的CD4+T和CD8+T细胞的活化明显降低,其表面CD69的表达显著减少,表明DMF可以减少a GVHD小鼠脾脏中的T细胞浸润和活化,减轻a GVHD的异基因免疫应答。(3)体外T细胞活化实验表明,DMF能够以剂量依赖的方式抑制T细胞活化,下调表面CD69,CD44以及PD-1的表达水平,但是却轻微上调CD25的水平。(4)通过细胞内染色检测移植后14天的受体小鼠的CD4+和CD8+T细胞分泌IFN-γ的水平。结果显示,DMF组受体小鼠脾脏CD4+T和CD8+T细分泌IFN-γ水平显著降低,与此一致的是,血清中炎症因子IL-6、IFN-γ和TNF-α的水平在DMF组也显著降低,表明DMF能够抑制Th1细胞的免疫应答,进而减轻a GVHD。(5)用活性氧检测试剂盒检测活化的T细胞中ROS水平,结果表明DMF可以以剂量依赖的方式抑制活化的T细胞中ROS水平;此外,通过q RT-PCR检测受体鼠脾脏中Nrf2,keap1和抗氧化防御酶HO-1和GST-α1的m RNA表达。结果显示,DMF组受体小鼠脾脏中Nrf2水平、HO-1和GST-α1的表达均显著上调,表明DMF能够促进抗氧化反应,抑制小鼠体内的氧化应激的水平。进一步通过免疫荧光实验证实,DMF能够促进T细胞内Nrf2的入核,Nrf2入核是其发挥抗氧化应激的主要机制。结论:DMF能够抑制供体T细胞同种异基因反应性以及促炎症细胞因子的分泌,上调抗氧化酶,减轻a GVHD。第三部分:靶向激活Nrf2信号通路促进Treg细胞分化发育目的:研究靶向激活Nrf2信号通路在Treg细胞分化发育中的作用,以及研究DMF减弱a GVHD是否是Treg细胞介导的。方法:采用流式细胞术检测移植后14d时DMF干预组和对照组小鼠脾脏中的Treg细胞的水平,观察DMF干预对小鼠Treg细胞的影响。通过磁珠分选小鼠CD4+T细胞,体外通过TGF-β和IL-2刺激建立Treg细胞诱导分化体系,通过给予不同浓度的DMF干预4d,研究DMF对Treg细胞体外分化的影响。采用BALB/c(H-2~d)小鼠作为受体。受体小鼠接受清髓性预处理(全身照射8.5Gy),通过输注5×10~6去除T细胞的骨髓细胞+1×10~6纯化的T细胞或者CD25-的T细胞,然后给予DMF干预处理,观察体内去除Treg细胞后,DMF对a GVHD的抑制作用是否仍然存在。ELISA检测移植后14d时小鼠血清中TGF-β的水平。建立体外混合淋巴细胞反应,加入不同浓度的DMF,3d后检测细胞培养上清中TGF-β的水平,研究DMF促进Treg分化的机制。结果:(1)流式细胞术检测发现和对照组相比,DMF组小鼠脾脏中Treg细胞的比例及绝对值明显增加,表明DMF在体内可以增加Treg细胞的数目。(2)体外Treg诱导分化实验表明DMF对Treg细胞的体外分化呈剂量依赖性促进作用。(3)为了进一步证实DMF对a GVHD的影响是通过促进Treg细胞来实现,我们将供者T细胞中的Treg细胞剔除,然后建立a GVHD模型并给予DMF干预处理,结果发现体内清除Treg细胞后,DMF组保护a GVHD的作用被减弱了,小鼠的生存显著低于DMF+不清除Treg细胞组。而在对照组中剔除Treg细胞,则不影响小鼠的a GVHD生存,表明DMF减弱a GVHD是通过Treg细胞介导的,剔除Treg细胞后DMF保护a GVHD的作用便减弱甚至消失了。(4)TGF-β是诱导Treg分化发育的最主要细胞因子,我们检测了a GVHD小鼠体内TGF-β和体外MLR体系中的TGF-β水平,结果表明DMF能够促进小鼠脾脏TGF-β的水平,体外呈剂量依赖性的促进TGF-β的分泌,表明DMF诱导Treg细胞分化主要是通过诱导TGF-β的表达来实现的。结论:靶向激活Nrf2信号通路减弱a GVHD是Treg细胞依赖的,体内剔除Treg细胞后DMF保护a GVHD的作用被明显减弱,DMF能够通过促进TGF-β的表达诱导Treg细胞的分化发育。第四部分:靶向激活Nrf2信号通路在GVL中的作用及机制研究目的:研究靶向激活Nrf2信号通路在allo-HSCT后移植物抗白血病(GVL)中的作用及机制。方法:采用C57BL/6(H-2~b)小鼠作为供体,采用BALB/c(H-2~d)小鼠作为受体。受体小鼠接受清髓性预处理(全身照射8.5Gy),通过输注1×107骨髓细胞+5×10~6脾脏细胞+1×10~6个带luciferase的A20细胞建立小鼠a GVHD/GVL模型。于预处理前3天予DMF灌胃(30mg/kg),连续给药7天。移植后每天两次观察小鼠生存状态,每3天进行a GVHD临床评估。移植后每周在小动物活体成像仪上实时观测小鼠体内的肿瘤负荷。将移植后两周的小鼠的脾脏细胞作为效应细胞,A20细胞作为靶细胞,采用Promega Cyto Tox96非放射性细胞毒检测试剂盒检测DMF作用后效应细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。采用CCK-8法检测DMF对A20细胞增殖和凋亡的影响。结果:(1)为了评估DMF对GVL效应的影响,a GVHD小鼠在异基因造血干细胞移植后用A20-luc白血病细胞攻击。结果表明只接受骨髓细胞加A20-luc白血病细胞移植的小鼠中,DMF组和对照组在移植后40天内全部死亡,两组生存没有显著差异,表明在没有T细胞的情况下,DMF不能发挥GVL效应,DMF在体内对肿瘤细胞的增殖没有没有抑制作用。但是当接受异体骨髓和脾细胞的移植小鼠加上A20-luc后再给予DMF,则能够显著延长小鼠的生存,小动物活体成像表明DMF干预组的肿瘤负荷更低,提示GVL效应得到保留,DMF能够通过增强T细胞功能发挥GVL效应。(2)体外细胞增殖实验表明低浓度的DMF对A20细胞的增殖和没有直接抑制作用,对细胞的凋亡也没有明显的促进作用。此外,细胞杀伤实验显示经DMF干预的受者小鼠的供体T细胞显示出更强的针对A20白血病细胞的CTL杀伤活性,表明DMF可以保持异基因造血干细胞移植后GVL效应。结论:DMF在抑制a GVHD的同时能够保留GVL效应,DMF对肿瘤细胞的增殖和凋亡没有直接作用,但是能够促进供体T细胞的细胞杀伤活性,从而发挥抗白血病效应。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前17条
1 王雪;张评浒;;Ras/Raf/MEK/ERK信号通路参与自噬调控作用的研究进展[J];中国药科大学学报;2017年01期
2 许莹萍;王菲菲;李大金;王凌;;雌激素-雌激素受体信号通路对趋化因子的调控作用研究进展[J];生殖医学杂志;2017年09期
3 苏依拉其木格;;Hedgehog信号通路在肺癌中的研究进展[J];健康之路;2016年09期
4 滕振平;邢飞跃;;细胞外信号调节激酶1/2信号通路对B淋巴细胞的影响[J];中国药物与临床;2007年01期
5 杜婵;姜保国;;许旺细胞增殖和分化过程中的信号通路[J];中国组织工程研究与临床康复;2007年03期
6 史琳琳;赵锋;高学军;李庆章;;乳蛋白合成信号通路的研究进展[J];中国畜牧兽医;2013年01期
7 舒扬;向敏;;Wnt信号通路在中枢神经系统中的作用及相关机制[J];江苏医药;2018年08期
8 刘晓光;陈佩杰;肖卫华;;Wnt信号通路在骨骼肌损伤修复过程中的作用及机制研究[J];生命的化学;2018年05期
9 刘艳芳;吴志远;;分子信号通路在瘢痕疙瘩中的研究进展[J];海南医学;2017年07期
10 郭龙;张春媚;高勇;赵忠岩;;ARDS发病机制的相关信号通路研究进展[J];中国实验诊断学;2017年09期
11 樊姿影;曾昊蓝;张世鹰;卢芳国;杨胜辉;;P38MAPK信号传导通路在HF治疗中的应用[J];环球中医药;2015年S1期
12 黄朝帅;陈二涛;冯东福;;神经干细胞增殖和分化相关信号通路的研究进展[J];临床神经外科杂志;2013年04期
13 张陶涛;王小竞;邢向辉;;牙根发育启动相关信号通路的研究进展[J];牙体牙髓牙周病学杂志;2011年09期
14 许永安;付小兵;;毛囊干细胞增殖与分化相关信号通路研究进展[J];中国修复重建外科杂志;2010年02期
15 匡野;李佩玲;;瘦素信号通路与小鼠生殖[J];中国优生与遗传杂志;2008年03期
16 许周媚;王清辉;查旋;徐道华;;音猬因子信号通路与骨质疏松症关系的研究进展[J];中国骨质疏松杂志;2017年04期
17 辛芳;王雷;刘梅;王宝杰;蒋克勇;孙国琼;;水产动物雷帕霉素受体信号通路的研究进展[J];海洋科学;2016年01期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 彭丽;章杰;刘伟;;病理性瘢痕相关信号通路的研究进展[A];2015江西省首届医学美容整形联合学术会议、江西省医学会第十一次医学美学与美容学术研讨会、江西省第四次中西医结合医学美容学术会议论文汇编[C];2015年
2 曾令启;叶章群;陈志强;杨为民;高文喜;;草酸激活人肾小管上皮细胞p38 MAPK信号通路的研究[A];中国中西医结合学会泌尿外科专业委员会第十四次全国学术会议暨2016年广东省中西医结合学会泌尿外科专业委员会学术年会论文集[C];2016年
3 王俊成;;炎症因子对成骨细胞分化过程中BMP信号通路的的影响[A];中华口腔医学会口腔修复学专业委员会第十次全国口腔修复学术大会论文集[C];2016年
4 苟黎明;李春洁;李龙江;;经典Wnt信号通路在下颌下腺分支形态发生过程中的作用与机制的初步研究[A];2017全国口腔颌面——头颈肿瘤外科学术研讨会论文集[C];2017年
5 谢玲;项晓琼;胡迎春;范宝星;霍艳英;李邦印;段瑞峰;张开泰;吴德昌;;细胞定位与信号通路检测技术在hrnt-1基因功能研究中的应用[A];中华医学会放射医学与防护学分会第三次全国中青年学术交流会论文汇编[C];2001年
6 林泓域;Yimon Aye;;Wnt信号通路与Nrf2信号通路之间的微妙关系——靶向化学平台T-REX在氧化还原信号通路研究方面的应用[A];第十届全国化学生物学学术会议论文摘要集(墙报)[C];2017年
7 张丽琳;常娜;蒋伶活;;镉胁迫下MAPKs信号通路的应答机制初探[A];第九届中国模式真菌研讨会摘要集[C];2016年
8 孙宏亮;许美花;王瑶;鲁文赓;;Wnt信号通路在牛胎盘发育过程中的功能[A];中国畜牧兽医学会兽医产科学分会第十三次学术研讨会论文集[C];2016年
9 陈娉婷;周小青;刘旺华;曹泽标;陈昱文;;中药对神经干细胞增殖分化相关信号通路调控研究进展[A];第九次全国中西医结合诊断学术研讨会论文集[C];2015年
10 蒋丽;;转录因子Bach1抑制Wnt信号通路和血管新生[A];中国生理学会张锡钧基金第十三届全国青年优秀生理学学术论文综合摘要、中国生理学会第十一届全国青年生理学工作者学术会议论文摘要[C];2015年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 张弛;神经肽Y调控成骨和破骨分化与Wnt信号通路相关的机制研究[D];暨南大学;2018年
2 吕慧;Nrf2-Keap1信号通路与多柔比星对白血病细胞K562作用的研究[D];苏州大学;2018年
3 陆文峰;新型刺猬信号通路抑制剂的设计、合成及活性研究[D];苏州大学;2018年
4 赵琳琳;OTUB1通过稳定DEPTOR从而负调控mTORC1信号通路[D];华东师范大学;2018年
5 王远;OSR1在调控Wnt信号通路和肺癌增殖、侵袭中的作用和机制研究[D];中国医科大学;2018年
6 程嵩奕;黄芪甲苷调控PTEN/PI3K/Akt信号通路介导心肌梗死后血管新生与心肌保护的实验研究[D];南京中医药大学;2018年
7 王凡;HIF-1信号通路在多囊卵巢综合征中的作用及其调控机制[D];福建师范大学;2017年
8 鲁茜;TGF-β1/PI3K/Akt信号通路在糖尿病肾病中的作用[D];南京医科大学;2013年
9 秦永新;HH信号通路在肺部炎—癌转化模型中的作用机制研究[D];大连医科大学;2018年
10 韩晶晶;Nrf2信号通路在急性移植物抗宿主病中的作用及机制研究[D];苏州大学;2018年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 樊春彪;小鼠原始生殖细胞迁移中的基因表达及调节通路分析[D];内蒙古大学;2018年
2 田志鹏;Brachyury基因突变模型小鼠胚胎发育中Wnt、FGF信号通路相关基因表达研究[D];内蒙古农业大学;2018年
3 邹凯;黄酮类药物对巨噬细胞中NLRP3信号通路的调控及缓解DSS诱导的小鼠结肠炎机制的研究[D];内蒙古农业大学;2018年
4 王洁;CTRP3通过AKT信号通路调节HepG2细胞LDLR表达及机制研究[D];山西医科大学;2018年
5 刘旭丹;RES通过TLR4与PI3K/Akt信号通路发挥抗IL-1β诱导的骨关节炎作用的体外实验研究[D];中国医科大学;2018年
6 高丹;B细胞受体信号通路抑制剂在慢性淋巴细胞白血病中疗效及安全性的meta分析[D];山西医科大学;2018年
7 王光熙;白藜芦醇的抗炎活性及其介TLR4/NF-κBp65/MAPKs信号通路发挥抗炎效应的机制研究[D];四川农业大学;2017年
8 周明星;基于Nrf2信号通路的天然抗氧化剂研究[D];山东大学;2018年
9 王盈盈;TGFβ1R-PI3K/AKT信号通路介导高糖诱导系膜细胞来源外泌体对足细胞的损伤及小檗碱的作用[D];安徽医科大学;2018年
10 王巾枚;SHH信号通路参与LPS诱导大鼠肺微血管内皮细胞表达RACK1[D];安徽医科大学;2018年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 本报记者 白毅;mTOR信号通路为肿瘤治疗提供新靶点[N];中国医药报;2010年
2 记者 王丹;最强激光“照亮”药靶重要信号通路[N];健康报;2015年
3 ;完美实现信号通路间的自由切换[N];通信产业报;2008年
4 本报特约撰稿 樊平;肿瘤信号通路靶点研发线吸睛[N];医药经济报;2018年
5 衣晓峰 陈英云 记者 李丽云;结肠癌发生中新的信号通路找到[N];科技日报;2009年
6 刘海英;美发现两种细胞信号通路互动机制[N];科技日报;2009年
7 衣晓峰;哈医大发现结肠癌发生中新的信号通路[N];中国医药报;2009年
8 记者 刘海英;英发现细胞信号通路新“刹车”蛋白[N];科技日报;2012年
9 中山大学肿瘤医院血液肿瘤科 吕跃 王华;难治性HL研究砥砺前行[N];医药经济报;2013年
10 刘禹 记者 王春;个体衰老速度差异谜团揭开[N];科技日报;2017年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978