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LOX-1调控骨关节软骨损伤的作用及机制的研究

沈鹏程  
【摘要】:第一部分 LOX-1在骨关节炎患者中的表达及临床意义目的:评价LOX-1和ox-LDL在骨关节炎患者中的水平变化,明确LOX-1和ox-LDL与骨关节炎患者功能水平之间的相关性。方法:纳入上海市第六人民医院行全膝关节置换术骨关节炎患者40例(n=40),采集软骨和滑液样本;同时从获得无OA史的对照个体40例,获得正常软骨和滑液。通过定量逆转录PCR评价LOX-1在骨关节炎患者中的表达水平。通过酶联免疫吸附法在关节滑液中检测ox-LDL。通过西安大略和麦克马斯特大学骨关节炎指数(WOMAC)评分对骨关节炎患者进行功能性评分。通过相关性分析,分别评价了LOX-1与ox-LDL的水平和WOMAC总分之间的相关性及LOX-1和ox-LDL两者水平之间的相关性。结果:相较于对照个体的关节软骨组织,LOX-1在骨关节炎患者的关节软骨组织中表达水平显著升高,差异有统计学意义(0.49±0.11 vs.0.33±0.04;p0.05)。相较于对照个体的关节滑液中ox-LDL的水平,骨关节炎患者关节滑液中ox-LDL的水平显著升高,两组个体比较差异有统计学意义([(64.8±18.3)mU/ml vs.(34.5±15.7)mU/ml;p0.05)。骨关节炎患者中LOX-1的表达与WOMAC总分之间存在相关性(相关系数r=0.805,p0.05)。骨关节炎患者中滑膜液中ox-LDL的水平与WOMAC总分之间存在相关性(相关系数r=0.786,p0.05)。骨关节炎患者中LOX-1的表达与滑膜液中ox-LDL的水平之间存在相关性(相关系数r=0.786,p0.05)。结论:LOX-1和ox-LDL在骨关节炎患者中的水平升高,它们能够反映骨关节炎患者功能,并且LOX-1和ox-LDL之间可能也存在着相关性。第二部分体外实验评价LOX-1在骨关节炎中的作用和机制目的:通过体外建立软骨细胞凋亡模型,评价LOX-1和ox-LDL对软骨细胞凋亡的调控作用及可能的机制。方法:在LOX-1中和抗体(10μg/ml)存在或不存在的情况下,采用ox-LDL(20μg/ml)和/或TNF-α(50ng/ml)处理融合度为70-80%的人关节软骨细胞,共处理24-48小时。通过台盼兰染色评价细胞的死亡;通过流式细胞术评价细胞的凋亡;通过胶电泳DNA片段测定法(DNA ladder)评价软骨细胞的凋亡。Western-blotting检测凋亡蛋白分子Caspase-8和Caspase-3的水平及自噬标记物LC3的变化。通过自噬抑制剂3-MA 及 Atg5 siRNA 处理后评价对上述 ox-LDL(20μg/ml)和/或 TNF-α(50ng/ml)诱导的软骨细胞凋亡的影响。结果:与对照组相比,单独使用TNF-α和ox-LDL对细胞死亡没有明显影响(TNF-α vs.ox-LDLvs.对照组:4.65±2.21%vs.6.86±4.65%vs.3.60±1.04%;P0.05)然而,结合使用TNF-α和ox-LDL可导致软骨细胞死亡显著增加,而Lox-1单克隆抗体可逆转这些作用(TNF+oxLDL vs.control:66.90±6.98%vs.3.60±1.04%;TNF+oxLDL vs.TNF+oxLDL+Lox-1 Ab:66.90±6.98%vs.11.40±1.50%;P0.05)。LOX-1 抗体中和能够降低TNF-α联合ox-LDL诱导的软骨细胞中DNA片段化增加及降低TNF-α联合ox-LDL诱导的软骨细胞中caspase-8和caspase-3水平增加的情况。Western-blotting及免疫荧光结果显示TNF-α联合ox-LDL处理的软骨细胞中细胞自噬的水平显著升高,而LOX-1抗体中和能够显著降低细胞自噬水平。通过3-MA抑制自噬或Atg5 siRNA抑制自噬能够产生类似LOX-1抗体中和对TNF-α联合ox-LDL诱导的软骨细胞的作用效应。结论:ox-LDL通过其与LOX-1的相互作用促进TNF-α介导的软骨细胞死亡,并且自噬作为机制参与到两者的作用效应中。第三部分体内实验评价LOX-1在骨关节炎中的作用和机制目的:通过体内建立实验性小鼠骨关节炎模型,评价LOX-1对软骨细胞的调控作用及可能的机制。方法:通过建立在内侧半月板去稳定(DMM)手术诱导骨关节炎,并且通过系统性注射LOX-1中和抗体进行治疗评价LOX-1抗体中和对骨关节炎小鼠疾病进展的影响,同时通过TUNEL染色法对小鼠软骨组织中的软骨细胞的凋亡情况评价,及LC3染色评价自噬阳性的细胞来对相关的机制进行阐明。结果:Safranin O染色的结果显示LOX-1中和抗体处理能够显著减轻骨关节炎小鼠的疾病严重程度。LOX-1中和抗体处理能够降低骨关节炎小鼠的OARSI评分(3.95±0.40 vs.5.80±0.50;p=0.007)及骨刺的水平(1.30±0.10 vs.1.65±0.10;p=0.02)。LOX-1中和抗体处理能够降低骨关节炎小鼠的滑膜炎症水平及评分(2.02±0.10 vs.2.70±0.28;p=0.02)。LOX-1中和抗体处理能够降低骨关节炎小鼠的胫骨平台软骨下骨中骨体积/组织体积(BV/TV)比,但是差异无统计学意义。LOX-1中和抗体处理能够显著降低骨关节炎小鼠软骨细胞的凋亡。LOX-1中和抗体处理能够显著降低骨关节炎小鼠LC3+软骨细胞的数量。结论:LOX-1中和抗体能够显著减轻骨关节炎小鼠的疾病严重程度,其主要是通过影响软骨细胞凋亡和降低LC3+软骨细胞的数量得以实现。


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