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抗血小板膜糖蛋白基因工程抗体的制备和性质研究

安广宇  
【摘要】: 血小板血栓形成是血管闭塞性疾病的主要成因。其表面的糖蛋 白Ⅱb/Ⅲa是血小板聚集最终共同途径的关键要素。阻断GPⅡb/Ⅲa 与纤维蛋白原的结合,能高效地抑制血小板的聚集,进而使血小板血 栓不能形成。SZ-21是我室制备的一株针对GPⅢa的单克隆抗体,经 家兔颈动—静脉血栓模型证实能显著降低血栓形成,显示了在抗血栓 治疗中的潜在价值。为降低鼠源性单抗免疫原性(HAMA)及全抗体Fc 段对血小板的破坏,本研究将SZ-21制备成小分子抗体,并对这一抗 体片段进行了纯化、复性和体外性质的研究。 一 SZ-21单克隆抗体可变区基因的克隆和序列分析 采用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,从分泌抗血小板膜 糖蛋白Ⅲa单克隆抗体SZ-21杂交瘤细胞中克隆了该抗体的重、轻链 可变区(V区)基因,并测序分析。SZ-21重链(V_H)基因全长为342 bp, 轻链(V_L)基因全长为306 bp,分别编码114和102个氨基酸。基因序 列登录号为VH:AF354053,VL:AF354054。 二 SZ-21单链抗体(SZ-21ScFv)基因的筛选和表达 为最大限度地保留单链抗体的血小板结合活性,利用噬菌体展示 技术进行了高亲和力筛选。将SZ-21 V_H和V_L基因分别与含有 (Gly_4Ser)_3多肽接头的载体pSW1-ScFv连接,构建成单链抗体基因 pSW1-SZ21ScFv,克隆到噬菌体分泌型表达载体pHEN1中。同时亲 和层析纯化血小板膜糖蛋白Ⅲa,用糖蛋白Ⅲa作为抗原进行高亲和力 筛选。经过四轮“吸附—洗脱—扩增”的富集过程,phage-ELISA 得到一个具有与血小板高亲和力的克隆,转化E.coli HB2151,表达 了可溶性ScFv融合蛋白。ELISA和Western blot证实该融合蛋白保 留了亲本抗体的血小板结合特性。 三 SZ-21单链抗体高效表达载体的构建及其在大肠杆菌中的融合表达 将上述筛选得到的单链抗体基因亚克隆到大肠杆菌融合型表达载 体pET20b中,得到pET20b-21ScFv。通过IPTG诱导在大肠杆菌E coli 抗血小板膜糖蛋白基因工程抗体的制备和性质研究 摘 要 BLZI(DE3)PlysS中表达了功能分子。SDS-PAGE和 Western blot显 示表达产物的分子量为27000。该融合蛋白除少量为分泌型表达外, 主要以包涵体形式存在,表达量占菌体总蛋白的 21%,约 20 m叭。同 时探索了该抗体片段的最佳复性条件。把包涵体形式表达的 SZ上 单 链抗体片段用尿素溶解,经过蛋白质的体外重折叠复性过程,成功地 得到具有活性的单链抗体片段。ELISA和Western印迹检测证实,该 鱼链抗体保留了与血小板特异结合的能力。 四SZ毛 的纯化和体外性质研究 通过NINTA树脂亲和吸附纯化,获得具有活性的高纯度单链抗 体片段,纯度达95%以上。流式细胞仪检测证实该单链抗体能与人脐 静脉内皮细胞和血小板反应。体外实验表明,SZ2 单链抗体能够抑 制 ADP诱导的血小板聚集,其抑制能力呈剂量依赖性,其 IC刃为 12 ug/mL,在浓度为20 ug/mL时达到最大抑制率。对花生四稀酸诱导的 血小板聚集亦有相似的抑制作用。此外,SZ上 单链抗体同样能够抑 制纤维蛋白原与血小板的结合,显示了其抗血栓作用。 以上结果表明,制备的基因工程抗体具有原鼠单克隆抗体的抗 血栓形成能力,减少了全抗体的人抗鼠抗体反应(HAMAh 同时该小 分子抗体片段去除了抗体的FC段,避免鼠源性单克隆抗体引起血小 板严重下降的副作用。该单链抗体有望用于抗血栓治疗。 五抗血小板膜糟蛋白单抗SZ毛 嵌合Fab片段基因构建和表达研究 利用基因克隆技术,从杂交瘤细胞系 SZ上 中克隆出轻、重链可 变区基因,然后亚克隆到含有人恒区基因C*和C。的质粒pSWIFab 中,构建成人一鼠嵌合Fab抗体片段质粒pSZ2,在大肠杆菌中表 达了可溶性*b抗体片段。SDS-PAGE显示在分子量(Mr)45 000处 有一诱导条带,与该嵌合抗体的理论计算值相符。表达量约为 800 fig/L, ELISA和Western检测证实表达产物具有与血小板结合的活性。


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