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鼠抗人B7-1分子功能性单克隆抗体的研制及其生物学特性的研究

梁文飚  
【摘要】: 机体的免疫应答是一个十分复杂的过程,由多种免疫细胞和免疫分子(膜分子和可溶性分子)参与并受到严格的调控。近来的研究表明,一组细胞膜分子即共刺激分子(costimulatory molecules)的调节性表达、相互作用及其信号传导在免疫应答过程中起着十分重要的作用,其中B7/CD28相互作用被认为是一个比较重要的信号传导途径。 编码人B7-1(CD80)分子的基因位于2q33,所表达的蛋白分子量为44-54KD,为Ⅰ型跨膜蛋白,属于免疫球蛋白超家族成员。B7分子以寡聚体形式表达于大部分抗原呈递细胞(APC)表面,如活化的B细胞、T细胞、树突状细胞(DC)及IFN-γ活化的单核细胞中。一般认为,CD28作为协同刺激分子的受体,通过与APC上B7分子的结合,起着传递信号,从而增强或放大免疫应答的效应;而CTLA-4负性调控T细胞的反应性。B7-CD28/CTLA-4介导的共刺激信号在T细胞活化,辅助性T细胞分化及效应性细胞因子分泌中起重要作用。通过增强共刺激信号,有利于肿瘤的排斥和肿瘤细胞的杀伤;而阻断共刺激信号,则可诱导T细胞特异性免疫耐受的产生,有助于自身免疫性疾病或超敏反应及异体移植排斥的防治。因此,研制抗人B7分子的功能性单克隆抗体并研究其生物学功能,具有重要的理论研究和应用价值。 杂交瘤株的构建:以人多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)细胞转入B7-1基因细胞株XG7-B7为免疫原,免疫BALB/C小鼠,采用B淋巴细胞杂 巨抗人87·l分子功能性单克隆抗体的研制及其生物学特性的研究 中文摘要 交瘤技术,将免疫后小鼠的脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行杂交,采 用聚乙二醇(polyythylene glycol,PEG)为融合剂,经HAT选择培养,以小 鼠成纤维细胞转人B7-l基因细胞株L-B7为抗体筛选阳性细胞株,以转基因 细胞的母本细胞几)作为阴性对照细胞株,经免疫荧光标记分析及抗体分 泌阳性孔内细胞的反复筛选并经多次的克隆化培养,最终获得4株持续、稳 定分泌鼠抗人 B7l(CD80)单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为 IFll、 3H8、6H2和7B10。经快速定性试纸分析法鉴定,它们分泌的Ig类别分别为 lgGI门 门、6H2、7B10)和lgM门H8)。经体外长期传代培养和液氮冻 存后复苏,杂交瘤细胞生长良好,分泌抗体的性能稳定。 InAb的生产及纯化:采用本室建立的腹水诱生和纯化方案,腹水形成 的阳性率为 90%,腹水的产量平均为 75 ml/只小鼠。经 ProteinG亲和层析 法和优球蛋白沉淀法获得纯化抗体。腹水型IYLAb经纯化后,单抗蛋白含量在 0石司刀mg/ml之间。免疫荧光法分析表明,腹水型单抗的效价为 1:1000以 上,纯化后抗体蛋白用于间接兔疫荧光分析的用量为 0.25-2刀 v g6 X 10’细 胞。 为了研究单克隆抗体对B7-l 分子表达细胞的识别和结合,选择表达 B7刁膜分子的恶性淋巴瘤细胞株Ran、EBV转化的人B淋巴母细胞株、体外 诱导的DC 和人扁桃体来源的淋巴细胞作为阳性表达细胞与单克隆抗体反 应,并以人T淋巴白血病细胞株Jurkat以及人外周血T细胞作为阴性对照。 经间接免疫荧光标记分析,结果显示,4株单克隆抗体均能识别不同细胞表 达的B7.1分子。 在与法国 Immunotech公司鼠抗人 B7* 克隆号 1976)的竟争 抑制实验中,IFll、6H2和 7B不能完全阻断阳性对照 mAb与相应抗原的 结合,提示该3株单抗与阳性对照ab识别不同的抗原位点。采用氯氨T 法将’‘’I标记单克隆抗体,通过’HI标记单抗与未标记单抗的配对竞争抑制 法分析表明,IFll与 6H2、7B所识别的抗原位点不同,6H2与 7* 0所识 别的抗原位点相同或相近。在此基础上开展了用于检测SCD80抗原试剂盒的 研制工作,并初步建立了 SCD80 ELISA检测方法,提示这些抗体可能具有潜 二I 鼠抗人B7.l分于功能性单克隆抗体的研制及其主物学特性的研究 中文摘要 在的临床应用价值。 在中和/阻断试验中,以XG7书7为刺激细胞,人外周血T淋巴细胞为 反应细胞,分析抗体对T细胞增殖的影响。经3H1dR掺入法证实,IFll、 3H8和6H2均能不同程度地阻断B7-1分子介导的协同刺激信号,从而抑制 B7-1 转基因细胞对人外周血T淋巴细胞的增殖激发效应(抑制率在 21%一52%),提示这 3株单抗是阻断型抗体,而 7B对 B7-1分子介导的协 同刺激信号没有阻断作用。 以天然表达B7q分子的人恶性淋巴瘤细胞株*


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