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BmNPV半胱氨酸蛋白酶、几丁质酶基因失活分析及hGM-CSF表达

石晓燕  
【摘要】: 杆状病毒表达系统是80年代发展起来的超高效真核表达系统,家蚕杆状病毒表达系统比普通杆状病毒表达系统又具有其多种特有的优势。 本论文对此表达系统进行了进一步改造,期望能使外源蛋白的表达水平达到更高。我们首先克隆了BmNPV_(su)半胱氨酸蛋白酶基因(Cysteine protease,CP)和几丁质酶基因(Chitinase,ChiA),并对两基因进行了序列分析。然后将它们分别克隆进pBluescriptⅡ SK(+)质粒,再在ChiA、CP之间插入含有BmNPV polh基因的片段,从而获得重组转移载体pBmChiA-polh—CP。 通过该重组转移载体与含hGM-CSF的重组病毒BmNPV-GMCSF的DNA共转染家蚕BmN细胞,使polh基因取代ChiA与CP两基因的启动子区域和部分编码区域,从而构建成CP和ChiA两基因同时失活、能表达hGM-CSF、并能形成多角体的重组病毒BmNPVpolh~+CP~-ChiA~-GMCSF~+。重组病毒感染BmN细胞实验表明:ChiA、CP两基因的失活不影响病毒的复制及多角体的形成,且感染细胞的存活时间比BmNPV-GMCSF、BmNPV感染的多2-3天;体外测活显示:重组病毒表达外源蛋白的活性比BmNPV-GMCSF的高10倍左右。重组病毒感染家蚕幼虫实验表明:感染重组病毒的蚕体,比感染BmNPV的死亡时间晚一到半天,且表皮不易破损。以上结果显示:ChiA、CP两基因为病毒复制非必需基因,且通过ChiA、CP两基因的失活,使家蚕杆状病毒表达系统表达外源蛋白的水平有了一定的提高;同时因为重组病毒可形成多角体,所以通过添食即可感染家蚕幼虫,解决了实际生产过程中病毒接种难的问题。


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