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胡萝卜(Daucus carota.L.)细胞外周糖蛋白结构及翻译后修饰的研究

商承伟  
【摘要】: 细胞外周糖蛋白(EDGP)是一种在SDS-PAGE中显示分子量为57000Da的糖蛋白,它由两种多肽构成,其氨基酸组成相似但等电点不同,pI分别为8.8和9.5。用层析法和层析等电点聚集法,从胡萝卜细胞悬浮培养液中提取和纯化了目的蛋白EDGP。应用MALDI-TOF-MS对纯化的蛋白质进行了鉴定。同时,将光谱测定数据与蛋白质数据库进行了符合率鉴定(MS-Fit),结果表明纯化的蛋白质确为EDGP。利用电喷雾质谱法对未变性的纯化EDGP的分子量进行鉴定,EDGP中含有4种分子量,分别为:48119 Da,48282 Da,48479 Da,和48705 Da。通过MALDI-TOF-MS,证实检测的氨基酸序列与佐藤等(1992)推导的EDGP氨基酸全序列相一致。测定结果表明,EDGP前20个氨基酸残基为信号肽序列,它在EDGP的成熟过程中被切除;成熟EDGP的N-末端被焦谷酰胺磷酸化修饰;EDGP的氨基酸序列中有11个潜在的磷酸化位点,其中7个没有被磷酸化修饰;在EDGP胰蛋白酶的水解产物中,这些未被磷酸化的多肽是T1、T5、T11、T15、T19、T23和T25。 通过用正碘乙酰-(5-硫基-1-奈基)乙二氨(1,5-I-AEDANS)对半胱氨酸的特异性荧光标记,并结合MALDI-TOF-MS对EDGP是否含有自由半胱氨酸进行了鉴定,结果表明:在EDGP中不含有自由半胱氨酸,即在EDGP序列中的12个半胱氨酸,形成分子内二硫键。通过比较存在或缺少还原剂条件下的肽谱差异,并依据MALDI-TOF-MS的分析结果,证实EDGP的半胱氨酸70与半胱氨酸158之间形成了二硫键。


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