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神经干细胞、嗅鞘细胞移植治疗大鼠脊髓损伤的实验研究

王葵光  
【摘要】: 第一部分:人及大鼠神经干细胞的分离培养及鉴定 神经干细胞(Neural Stem Cells,NSCs),在一定条件下能定向分化为神经元、神经胶质细胞和少突胶质细胞,故理论上神经干细胞具有修复神经系统疾病及损伤的能力。但在其应用于临床之前,首先必须分离、培养并获得相对纯化的神经干细胞,掌握其自我繁殖、更新、传代、分化等规律,所用培养液和添加剂应尽最大努力保持NSCS的原始活力。本研究取孕16天SD大鼠胚胎大脑皮层组织,或新生3天的SD大鼠海马组织,孕3月人胚胎大脑皮层组织或孕4.5~7月人胚胎海马组织,通过无血清培养技术,在体外进行传代培养获取神经干细胞,并对其分裂、分化等特点进行研究和比较。结果表明:①在适宜的浓度体外培养条件下,NSCs能形成典型的神经干细胞克隆球,Vimentin免疫荧光染色阳性,单靠丝裂原刺激或NSCs自我调节和分化诱导,不会产生典型的终末分化的成熟神经细胞;②海马源性的NSCs维持干细胞特性的时间更长,生物学特性更优;③传至第2~3代的NSCs尚未分化时移植最佳;④体外培养的NSCs能自我调控分化为神经元、星形胶质细胞、O2少突胶质细胞、雪旺氏细胞染色阳性克隆球和前体细胞;⑤各种子代克隆球和细胞存在广泛的突触联系;⑥NSCs与OECs联合培养时,不需丝裂原刺激即能形成克隆球,获得大量Vimentin、GFAP、MAP2、O2、p75NGFR、GFAP、S-100、Synaptosis、Vimentin、Tau(Tau只有人HNSCs+HOECs联合培养时出现阳染)染色阳性的克隆球和细胞;⑦脊髓研磨后的上清液刺激神经干细胞向神经元方向分化,但并不出现终末分化;⑧本研究培养条件不利于成纤维细胞、O4生长。 第二部分:人及大鼠嗅鞘细胞的分离培养及鉴定 嗅鞘细胞(olfactory ensheathing cells/glials,OECs/OEGs)是使中枢神经系统轴突再生的最强有力细胞。脊髓损伤后轴突脱髓鞘,胶质增生不利于轴突再生,然而近十年来动物试验和临床研究证实OECs移植治疗脊髓损伤可取得较好的疗效。分离、培养、获得相对纯化的OECs是关键。本研究采用无血清培养技术、对嗅鞘细胞理化特性影响较小的纯化方法进行定量培养,并进行相关鉴定。本研究证实:①无血清体外培养条件能够满足OECs短期体外培养要求,培养第15天是OECs的最佳移植时机,其中HOECs以3~6×10~6/ml的浓度培养时生长状态 神经干细胞、嗅鞘细胞移植治疗大鼠脊髓损伤的实验研究 中文摘要 良好,具有临床应用价值;②嗅鞘细胞可形成克隆球,具有传代和分化能力,培 养巧天后开始长出轴突并开始分化,但仍保留某些神经干细胞的特点,尚未产 生典型的终末分化的成熟神经细胞;③阿糖胞营法去除成纤维细胞,简单易行, OECs纯度可达90%以上;④贴壁的嗅鞘细胞发出大量轴突反复分支、形成网络; ⑤HOECS 04抗体(一),而ROECS有大量细胞04抗体(+);⑥NSCS与OECs 联合培养时,不需丝裂原刺激即能形成克隆球,获得大量Vimentin、GFAP、 MAPZ、02、p75NGFR、GFAp、S一100、Syn即tosis、Vimentin、几u(丁hU只有 人HNSCs+HOECs联合培养时出现阳染)染色阳性的克隆球和细胞;⑦嗅球可 能存在p75NGFR、GFAP(+)或5100(+)类型的两种嗅鞘细胞;⑧本研究培 养条件不利于成纤维细胞生长。 第三部分:大鼠神经千细胞移植治疗陈旧性脊髓挫伤的实验研究 尽管NSCS的体外培养、分化和鉴定已取得丰硕的成果,但有关NSCS移植 治疗脊髓损伤的实验研究尚显不足。本研究参照Allen方法制成大鼠陈旧性脊髓 挫伤动物模型,将传至第二代的RNSCS以1 x 10”/L采用立体定向技术移植入大 鼠脊髓挫伤区,采用下几rlov评分、斜板试验、爬梯试验、CBS联合评分、电生 理检查、磁共振检查、HRP神经示踪、HE染色、透射电镜观察、免疫组化检测 和图像分析等方法研究RNSCS移植后大鼠的功能恢复和RNSCS在脊髓内的分 布、分化。本研究证实:①大鼠脊髓挫伤后有一定的自我功能恢复,RNSCs移 植可明显改善大鼠的感觉、自主运动功能和膀肤自主排尿功能;②RNSCS植入 陈旧性挫伤脊髓后可检测到Vimentin染色阳性细胞和克隆球,仍有部分RNSCs 保持神经干细胞的特征;③BrdU追踪结果示移植入脊髓内的RNSCS至少向头、 尾侧迁移1.scm;④免疫组化阳性面积分析示RNSCS移植后主要分化为神经元、 雪旺氏细胞和少突胶质细胞,星形胶质细胞极少;⑤免疫组化阳性面积分析示 RNSCS移植后各种细胞形成广泛的突触联系,成纤维细胞数量较少;⑥电镜证 实RNSCs能够在脊髓内存活,细胞内存在大量的粗、滑面内质网、核糖体、高 尔基复合体、线粒体、溶酶体、脂滴、突触小泡,与脊髓组织融合良好,移植后 髓鞘再生良好、轴突外包绕有胞浆丰富的雪旺氏细胞和少突胶质细胞;⑦SEP及 MEP的检测表明RNSCS移植后挫伤脊髓的感觉、运动神经传导通路己恢复;⑧ HRP神经示踪显示示踪剂经神经轴突运输穿过脊髓挫伤区域;⑨大鼠脊髓损伤 神经干细胞、嗅鞘细胞移植治疗大鼠脊髓损伤的实验研究 中文摘要 磁共振表现与人类相似;⑩使用高浓度、小体积HNSCS移植、局部降温、脊髓 表面浸润麻醉、立体定位仪和较细的穿刺针应成为临床神经干细胞脊髓内移植的 原则。


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