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GDNF对实验性脑出血大鼠保护作用机制的研究

王运良  
【摘要】: 脑出血是严重危害人类健康、致死致残率较高的疾病。自发性颅内出血是最 常见的出血类型之一,发病率每年12-35/10万,占全部卒中的8%-14%。常见的 出血部位是纹状体、小脑和桥脑,30天死亡率为41%-51%,多数幸存者残留不同 程度的神经功能丧失。脑出血的病因尚未完全阐明,对出血后脑损伤机制的研究 结果报道不一。大多认为血肿的占位效应对脑组织的直接压迫、血肿周围的缺血 性损害使脑血流量下降,脑细胞缺氧使能量代谢障碍,血管活性物质如儿茶酚胺 释放、兴奋性氨基酸、自由基生成增多、细胞钠水潴留导致细胞肿胀,血肿内红 细胞破坏释放凝血酶及再灌损伤时的钙超载进一步加重细胞膜破坏,使毛细血管 通透性增加,血脑屏障开放而引起的继发性脑水肿是脑出血后神经功能恶化和死 亡的主要原因。虽经数十年的努力,有关脑出血的治疗仍未取得突破性的进展。 目前临床上多沿用控制血压和预防和治疗颅内压升高的传统疗法。尽管对脑出血 进行了血肿清除的有益探索,但主要限于小脑和表浅的脑叶出血,对基底节和深 部血肿手术清除无明显益处。由于脑组织结构的复杂性及脑出血是通过多种机制 引起脑组织损害,单凭血肿清除及传统治疗很难达到神经功能康复的理想效果。 寻找有效的治疗途径,最大限度的减少脑出血后死亡率及改善神经功能恢复成为 神经科领域关注的热点。我们研究的目的是模拟自发性脑出血动物模型,利用营 养因子对神经原保护的特点,探讨外源性基因通过细胞转染对脑出血的保护作用 及对神经功能康复的影响,为临床治疗脑出血开辟新途径提供科学的理论依据。 胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)是近年来发现并已被克隆纯化的一种高 效能的营养因子。早期研究发现,GDNF对中脑多巴胺能神经原有专一的营养作 用,能促进多巴胺能神经原的发育、分化、存活功能。近来研究证实,GDNF不 仅对多巴胺能神经原,对中枢和周围神经系统的运动、感觉神经原,自主神经原 均有相同的营养和保护作用,促使神经原再生和免受外界损伤引起的凋亡及促进 存活作用。GDNF通过靶源性和局部性两种方式表达其生物活性。当脑组织受外 界刺激时,损伤区细胞分泌GDNF增加内源性营养因子的基因表达,增强脑组织 GONF对实验性脑出血大鼠保护作用机制的孑讲究摘要 的抗损伤作用,使神经原的可塑性和自我保护机制得到加强。众多证据表明,脑 损伤时GDNF与其特异受体结合,启动细胞内信号传导途径产生相应的效应分子, 以维持细胞内钙调节,减少自由基损伤,保护细胞和溶酶体膜等对神经细胞起保 护作用。GONF已用于脑梗塞、脊髓损伤等疾病模型的实验治疗,但对脑出血的 研究还未见报道。我们研究的目的是克隆大鼠的GDNF基因,通过连接载体转化 入出血大鼠的脑组织内,在不同的时间点观察GDNF对脑出血的保护作用及对神 经功能变化的影响。 一、大鼠GDNF基因克隆 1,目的:克隆大鼠GDNF前体蛋白cDNA序列,用于观察对脑出血治疗和保护作 用。 2.方法:从孕17(E17)d大鼠胎脑中提取总RNA,纯化后用于合成cDNA第 一、二链,加入自行设计的引物5,GAA AAG CTT ATG AAG TTA TGG GAT GTC一3’, 5’GGC GGA TCC TTA GAT AGA TCC ACT CCG一3,。通过PCR扩增目的基因,电泳 证实片段长度正确,经相应酶切后,与质粒pCDNA3连接。经与感受态细菌转化, 挑取阳性菌落送公司测序。通过引物5’TAT ACG AAT TCG CGG CCG砚G CCA CCA TGG AGC AAG一3,,5,ATA CTC GAG GCG GCC GCT CAC TTG TAC AGC‘rCG TCC一3, 在GFP质粒上扩增出GFP片段并经相应酶切后插入上述构建好的质粒中,制备出 本实验用的实验干预表达质粒。 3结果:①提取的RNA纯化后经琼脂糖凝胶电泳出现185和285两条带,说明 成功提取RNA。 ②提取的RNA经逆转录合成cDNA第一、二链,PCR扩增后电泳,并与标准Mar认er 比较显示为63Obp大小片段,与预期的结果相一致。③与质粒pcDNA3连接,由 中科院细胞所生物技术部测序结果为633bp。与文献报道序列相同。 二、脑出血大鼠模型制备及指标观察 1.目的:制备实验性脑出血大鼠模型,观察脑出血后对大鼠脑组织和神经功能 的影响。 2.方法:①雄性SD大鼠,体重250一30摊,取自体动脉血50 pl注入尾状核建立 出血模型。生理盐水(NS)组于相同部位注射50 pl生理盐水,假手术组针刺右 侧尾状核。②观察实验前后大鼠体重、体温、心率、血压并称重。③在实验后 GONF对实验性脑出血大鼠保护作用机制的研究摘要 比、3卜、61飞、12h、24h、72h、7d、14d监测大鼠的脑血流,并进行神经缺损 评分。④测定大鼠双侧皮质和尾状核的含水量及钠、钾含量。⑤用伊文思蓝(Evin: 田。e)观察大鼠血脑屏障(BBS)的改变。 3.结果:①与NS和假手术组相比较,脑出血大鼠体重明显减轻,以出血后3h一72h 减轻明显,NS组在12h一24h有体重减轻,假手术组体重无明显变化。三组大鼠 实验前后体温、心率、血压无明显改变。②脑出血组同侧皮质和尾状核rCBF明 显降低,脑出血组神经缺损评分也明显高于其它两组。③脑出血组大鼠脑组织含 水量


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