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人胚胎神经干细胞体外诱导分化及其分化相关基因表达的研究

王飞  
【摘要】: 第一部分:不同胎龄的人胚胎神经干细胞的体外培养研究 【目的】探索人胚胎神经干细胞体外分离培养的条件,并观察其在体外增殖、分化的特点;建立人胚胎神经干细胞分离、培养及分化的鉴定技术,在体外大量扩增培养神经干细胞,为下一步的研究提供足够的材料。 【方法】分别取水囊引产4月胎龄的人胚胎和米非司酮流产6-10周胎龄的人胚胎,从胎脑皮层分离组织,采用胰蛋白酶消化和机械吹打的方法获得单细胞悬液。部分细胞冻存,另一部分细胞进行体外培养。采用无血清培养基(DMEM/F12),加入EGF和bFGF(20ng/ml)刺激细胞增殖,从而进行体外扩增培养、连续传代。采用HE染色和相差显微镜观察细胞形态,常规Giemsa染色观察神经干细胞的染色体,免疫细胞化学和免疫细胞荧光法鉴定神经干细胞(Nestin)和分化成熟的神经元(NSE)、星形胶质细胞(GFAP)及少突胶质细胞(CNP)。用流式细胞仪和细胞生长曲线法检测神经干细胞的增殖能力。 【结果】从人胚胎脑分离的细胞在含有EGF和bFGF的无血清培养基中,能形成大量的神经干细胞球,这些神经干细胞球可在体外扩增及传代培养。免疫细胞化学和免疫细胞荧光法鉴定神经干细胞球中大部分为Nestin表达阳性细胞。这些神经干细胞球贴壁分化后可以出现NSE、GFAP和CNP表达阳性的细胞。经冻存后的胎脑细胞也能培养出具有同样特征的神经干细胞。流式细胞仪和细胞生长曲线的结果表明神经干细胞在体外无血清培养加入EGF和bFGF(20ng/ml)的条件下具备较强的增殖能力。 【结论】从引产或流产的不同胎龄人胚胎脑皮层分离出的细胞,在含有EGF和bFGF的无血清培养基中培养,见到了具有自我更新能力和多向分化潜能的神经干细胞。经 人胚胎神经干细胞体外诱导分化及其分化相关基因表达的研究中文摘要 冻存的胎脑细胞同样能培养出具有同样特性的神经干细胞。特别是从药物流产的人胚 胎脑皮层可以培养出神经干细胞,加上取材方便,可以认为本研究研究建立了一个随 时需要随时可取的“神经干细胞库”。 第二部分:人胚胎神经干细胞体外增殖、分化的研究 【目的】探讨在体外培养过程中影响神经干细胞增殖和分化的因素。 [方法]人胚胎神经干细胞被分为4组:EGF组(仅加20ng/ml EGF)、bFGF组(仅 加Zongzml bFGF)、EGF+bFGr组(加bFGF和Eer各Zong/ml)、对照组(不加 生长因子)。在培养的第l一6天,每天用MTT法测定细胞的OD值。取人胚胎脑细 胞(不加生长因子)培养,于第1、3、7天用流式细胞仪测细胞周期;取原代培养的 人胚胎神经干细胞于第3、7天用流式细胞仪测细胞周期。人胚胎神经千细胞接种到 多聚赖氨酸处理的24孔细胞培养板,分别在第1、3、7、10、14天进行免疫荧光染 色,计数GFAP、NSE染色阳性的比率。人胚胎神经干细胞接种到放置有多聚赖氨酸 处理的玻片的24孔细胞培养板,分别用不同浓度的胎牛血清(l%、3%、5%、10%) 诱导其分化,诱导10天后进行免疫荧光染色,计数GFAP、NSE染色阳性的比率。 人胚胎神经干细胞接种到放置有多聚赖氨酸处理的玻片的24孔细胞培养板,被分为 3组:EeF组(仅加Zongzml EGF)、bFGF组(仅加20ng/ml bFGF)、对照组(加 bFGF和EcF各20ng/ml)。撤去生长因子后细胞开始分化,10天后进行免疫荧光染 色,计数GFAP、NSE染色阳性的比率。 [结果】MTT法的结果表明,EGF十bFGF组的OD值明显高于其他各组,提示 EGF+bFGF组的细胞增殖能力最强。流式细胞仪的检测结果为:原代培养3d的和 7d的人胚胎神经干细胞,GZ一M/S期分别为9.39%和9.51%。而人胚胎脑细胞(不加 生长因子)第ld,GZ一M/S期为5.38%;培养3d时GZ.M/S期为3.07%;培养7d时 GZ一M/S期0.77%。这提示在生长因子EGF和bFGF的作用下神经干细胞可处于增 殖状态。不加生长因子,神经干细胞逐渐停止增殖。人胚胎神经干细胞在贴壁分化1 天时,神经元和星形胶质细胞的比例分别为1.“士0.50%和1.78士0.39%;到贴壁分 化14天时,神经元和星形胶质细胞的比例分别达到16.83士0.41%和82.37士0.84%。 加入1%胎牛血清后,NSE染色阳性细胞与对照组比明显减少(P0.01)。随胎牛血 人胚胎神经干细胞体外诱导分化及其分化相关基因表达的研究中文摘要 清浓度的增加,与对照组相比,GFAP染色阳性细胞明显增加,NSE染色阳性细胞明 显减少(P0.01)。ECF组与对照组相比,NSE染色阳性细胞明显减少,GFAP染色 阳性细胞明显增加(P0.01)。bFGF组与对照组相比,NSE染色阳性细胞明显增加 (P0 .01)。 【结论】EGF和bFGF能在体外培养条件下促进和维持人胚胎神经干细胞的分裂和 增殖。人胚胎神经干细胞的分化受多种因素影响。随贴壁分化时间的延长,人胚胎神 经干细胞逐渐分化为成熟的神经元和星形胶质细胞。胎牛血清的浓度越高,人胚胎神 经干细胞分化为星形胶质细胞的比例越多。EGF诱导人胚胎神经干细胞更多的分化 为星形胶质细胞,bFGF诱导人胚胎神经干细胞更多的分化为神经元。 第三部分:维甲酸诱导人胚胎神经干细胞向神经元 分化及相关基因的表达 【目的】探索全反式维甲酸对人胚胎神经干细胞的诱导分化作用,并研究在人胚胎 神经


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