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多巴胺神经毒性与帕金森病关系的实验研究

栗超跃  
【摘要】:目的 探讨多巴胺(Dopamien,DA)神经毒性在帕金森病(Parkinson's Disease,PD)发生发展中的作用以及可能机制,为PD药物筛检提供理论基础;针对多巴胺神经毒性作用,从调节多巴胺在细胞内外的分部和减少或减缓多巴胺能神经元丢失两个方面,以多巴胺转运体(Dopamine Transporter Protein,DAT)和乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase,AChE)为基点,研究山梗菜碱(洛贝林)和乙酰胆碱酯酶抑制剂Huperzine A在PD治疗中的作用。 方法 利用多巴胺能神经母细胞瘤SK-N-SH、SH-SY5Y细胞和稳定表达DAT的CHO细胞(命名为D8细胞)研究多巴胺的毒性作用,通过倒置显微镜观测细胞损伤和Hoechst33258标记、FACS、电镜、DNA ladder以及TUNEL(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated nick end labeling,TUNEL)检测DA诱导多巴胺能神经元凋亡特征和RT-PCR检测caspase-3和bcl-2基因的表达;体内直接在内侧前脑束(medial forebrain bundle,MFB)处注射DA(1μ mol),用Apomorphine诱导偏侧旋转从行为上判定多巴胺能神经损伤程度和尼氏染色、酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)免疫组化标记黑质多巴胺能神经元显示多巴胺注射后不同时间内的损伤情况以及TUNEL和DNA ladder电泳检测细胞凋亡特征;利用6-羟基多巴胺(6-bydroxydopamine,6-OHDA)制作的PD模型直接检测洛贝林对黑质纹状体多巴胺系统的作用和洛贝林对纹状体突触体和D8细胞摄取~3H-DA的影响;AChE组化染色和RT-PCR检测DA、6-OHDA和MPTP诱导SK-N-SH、SH-SY5Y和D8细胞以及AChE 多巴胺神经毒性与帕金森病关系的实验研究中文摘要 组化染色检测DA、6一O工IDA和MPTP在体损伤后黑质细胞的AChE, FAcs和MTT检测H叩erzineA对多巴胺能神经毒性作用的抑制率;利用 滚筒实验和游泳实验检测洛贝林和H叩erzineA对1一甲基一4一苯基一1,2, 3,6一四氢毗睫(一ethyl一4一phenyl一l,2,3,6一tetrahydroPyridine,MPTP) 行为学的影响和TH免疫组化及尼氏染色检测黑质多巴胺能神经元损伤 程度。 结果 在镜下观察到DA和6一OHI〕A可以直接造成多巴能神经元和表达DS 细胞损伤,而CHO细胞没有受到损伤;吉姆萨染色、Hoechst33258标 记、FACS、电镜、DNA ladder以及TUNEL均检测到细胞凋亡特征;在 DA诱导的细胞中检测caspase一3表达,而不加药组无表达,bcl一2在DA 组表达量显著高于不加药组;一周后用Apomorphine可以诱导多巴胺注 射鼠向对侧旋转;TH和尼氏染色显示黑质选择性多巴胺能神经丢失; TUNEL和DNA fadder电泳分别显示多巴胺注射侧黑质细胞出现调亡细 胞典型特征;洛贝林可以有效的减少APomorphine诱导的偏侧旋转 (p0 .05)以及有效抑制纹状体部突触体摄取3H-DA;洛贝林有效抑制 DS细胞摄取3H-DA,而对DS细胞释放作用不显著;洛贝林可以有效减 少N田P+对DS细胞的毒性作用;滚筒和游泳实验显示:高剂量(3m叭g) 的洛贝林可以有效改善运动障碍(P0 .05),而低剂量(lm叭g)的效 果不显著(P005);通过TH免疫组化和尼氏染色显示:高剂量组的洛 贝林可以达到保护黑质多巴胺能神经元的作用(P0.05),而低剂量效 果不显著(P0.05);用多巴胺能神经毒物质诱导的细胞凋亡有乙酞胆 碱酷酶的参与,定位于凋亡的细胞核;MTT和FACS检测显示huPerzine A可以有效抑制多巴胺能神经毒性作用,细胞损伤减少达40%左右;滚 筒实验和游泳实验显示huperzineA(0 .2m叭g)与左旋多巴一样可以 有效改善MpTP诱导的小鼠帕金森病模型的运动障碍(P0 .05);酪氨酸 经化酶免疫组化和尼氏染色显示huperzineA能够有效保护中脑黑质多 fl 多巴胺神经毒性与帕金森病关系的实验研究中文摘要 巴胺能神经元,与生理盐水处理组比较差异有显著性(P0.05),左旋 多巴处理组细胞受损严重(P0.05)。 结论 1.DA在体外可以造成多巴胺能神经细胞损伤,凋亡方式是多巴胺能 神经细胞丢失的机制之一:首次证明在MFB注射的多巴胺能够诱导 中脑黑质多巴胺能神经元选择性丢失,凋亡方式是多巴胺损伤中脑 黑质神经元的机制之一。 2.首次证明洛贝林在体影响黑质纹状体多巴胺系统,直接抑制DAI的 重摄取,有效改善MPTP诱导小鼠帕金森病模型的运动障碍,对PD 具有潜在的治疗价值。 3,首次发现乙酞胆碱酷酶参与多巴胺能神经元凋亡过程,其抑制剂 HuPerzineA有效抑制多巴胺能神经细胞凋亡,显著改善MPTP诱导 小鼠帕金森病模型的运动障碍,HaperzilleA可以用于帕金森病的药 物治疗。


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