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间日疟原虫裂殖子表面蛋白1(PvMSP-1)基因多态性研究

张山鹰  
【摘要】:目的 研究我国不同疟疾流行区间日疟原虫裂殖子表面蛋白1(PvMSP-1)基因序列特征,探索PvMSP-1等位基因型及其地理分布,不同等位基因型与疟疾流行特征的关系,评价PvMSP-1作为分子标志在疟疾分子流行病学调查中的意义及应用前景。方法 选择代表我国不同地理环境和流行特征的间日疟流行区调查点,设计疟疾个案调查表,收集疟疾流行病学资料,采集间日疟病人血液样本供基因检测;根据PvMSP-1基因序列特征设计特异性引物,用套式PCR扩增ICB5-ICB6多态区包含Belem株的PolyQ大约500bp大小的DNA片段,PCR产物纯化并进行序列测定,通过GenBank进行序列比对,用基因软件分析基因型,结合限制性片段长度多态性(RFLP)技术进行基因型鉴定,建立一套适用的基因型鉴定方法,并应用于福建省输入性疟疾的追踪调查和暴发点性质判断;另一个重要分子标志环子孢子蛋白(CSP)基因对比分析我国间日疟原虫分离株基因多态性特征;观察不同PvMSP-1基因型生物学形态差异。结果① 82份间日疟原虫现场分离株扩增出470bp片段50份,400bp片段39份,其中7份为两种片段的混合型。海南分离株混合型为20%(6/30),平均克隆数为1.20(36/30),安徽分离株混合型仅为2.3%,平均克隆数1.02。对33份样本进行序列测定,Sal-1型17份,Belem型2份,12份重组型(Ⅲ型)和朝鲜型2份为我国新发现基因型。② 98份间日疟血样经套式PCR扩增均出现大小约为400bp(Belem型)或470bp(Sal-1型)的特异性片段。酶切消化后,45份470bp的样本出现120bp和350bp酶切片段,为Sal-1型;40份400bp的样本中3份仅出现一条400bp片段为Belem型,35份出现120bp和280bp两种酶切片段为Ⅲ重组型,2份120bp和240bp片段,应为朝鲜型。选择部分代表不同酶切图谱基因型样本的PCR产物进行测序鉴定,结果与PCR-RFLP结果完全符合,该技术成本低,操作方便快捷,结果可靠。③ 16例镜检确诊的间日疟病人血样经套式PCR-RFLP检测,7例属Sal-1型,1份为Belem型,8份为重组Ⅲ型。对其中7份样本PCR产物进行DNA直接测序,发现没有2个DNA序列是 间臼疟原虫裂殖子表面蛋白基因多态性研究 中文摘要 完全相同的,通过DNA序列搜索结合流行病学调查可确定这些病例为输入性的,可 初步判断其感染来源。④对海南省疟区32份样本同时用MSP一1和CSP分子标志进 行分析,PvMSP一基因混合感染率为1 8.跳,平均克隆数为1 .16;PvCSP混合感染 率为35.3%,平均克隆数为147,同时考虑两种标志则不同基因型混合感染率为50%, 应用SPSS软件包进行对应分析发现热带族与S:,1一1型关系密切,Pvn型与重组111 型分布靠近,其它基因型分布较为分散。⑤显微镜观察72份血片,均找到典型间 日疟原虫,以滋养体为主,一般形态学观察Belel。型和Sal一1型无明显差异,用测 微尺测量环状体Belem型环状体大小平均大于Sal二型,海南分离株红细胞感染两 个以上疟原虫多见,Belem型为22.2%,Sal一l型为n.瑞,安徽分离株无发现此现 象。结论我国间日疟原虫尸vMSp一1存在4种不同的等位基因型,以Sal一1型和重 组.型(111型)占优势,南部疟区多克隆感染常见,基因型比北部复杂。PvMSP且基 因可卜作为重要分子标志用于疟疾流行病学调查、病原追踪、流行特征判断和疫情的 预测预报,两种以1二分子标志综合应用可更好地分析、了解疟疾流行规律。


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