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骨髓基质细胞向神经细胞分化及对帕金森病的治疗

单立冬  
【摘要】:目的:骨髓基质细胞(BMSCs)在一定的体内外环境条件下可分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌母细胞及神经细胞。近年来骨髓基质细胞向神经元样细胞定向分化及其对神经系统疾病的治疗成为干细胞研究的热点问题。决定骨髓基质细胞定向向神经元方向分化的因素及方案很多,但是目前所采用的各种方案所获得的神经元样细胞比率虽然很高,但其凋亡速度较快,所以寿命很短,给人们的研究带来了不便,也阻碍了研究的进一步深入。本实验拟用抗坏血酸(AA,也称维生素C,Vc)、成人脑脊液(CSF)及在前人的方案中加入不同的营养因子对骨髓基质细胞中的各种亚型细胞进行诱导分化,观察各种亚型细胞对不同诱导剂的反应,以期找到一种较温和、安全的诱导方案。同时采用预诱导的骨髓基质细胞移植治疗帕金森病(PD)模型大鼠,观察其作用疗效,为将来临床应用提供一定的理论依据。BMSCs可以在DMEM、DMEM/F12、α-MEM、MesenCult等多种培养基中生长,BMSCs各亚型细胞在不同的培养基中的生长状态及速度是否一致,对于评价各个实验室的研究结果尤其重要。因此本研究拟选用DMEM和MesenCult两种培养基观察BMSCs各亚型细胞在这两种培养基中的生长状态。 方法:常规方法分离人骨髓基质细胞(hBMSCs)及大鼠的骨髓基质细胞(rBMSCs)。(1) 分别用DMEM及MesenCult两种培养基培养人骨髓基质细胞,观察人骨髓基质细胞中各亚型细胞原代及传代细胞在它们中的生长情况。用直径为10μm的微孔滤膜,分离小圆细胞,观察其生长状况;第二、三代的骨髓基质细胞进行有限稀释后种植于96孔板中,于不同时间观察各种亚型细胞的生长速度及形态变化。(2) 当第二、第三代的骨髓基质细胞生长达60%-70%融合时,将基础培养基弃除,分别加入不同病人的脑脊液、抗坏血酸、丁羟茴醚/二甲基亚砜(BHA/DMSO)混合液中加入脑源性神经营养因子(BDNF)、神经营养因子-3(NT-3)、白介素-1(IL-1)、(白介素-11)IL-11、白血病抑制因子(LIF)、血小板源性生长因子(PDGF)的或血清,于诱导的 于位瓜质佃胞向种妞佃脸合化反对朽全森偏的治行 中奚人摘要 不同时间点,观察各亚型细胞的形态学变化及对其进行免疫细胞化学染色鉴定。用 HPLC方法检测诱导液中单胺类递质含量。(3) PD大鼠随机分为对照组和实验组。 对照组分为正常对照组,DMEM配液组和BDNF/NT一3配液组;实验组分为未诱导的 BMSCs/DMEM组、诱导的BMSCs/DMEM组和诱导的BMSCs/BDNF/NT一3组。移植后一个月 用阿朴吗啡(APO)诱导旋转,检测其行为学变化,之后处死,常规灌流、固定作 免疫组织化学染色。 结果:(l)hBMSC:在MesenCult中生长较快,而在DMEM中生长较慢,并且用 MesenCult培养的hBMSCs中含有的小圆细胞数量较少,而用D州[EM培养的hBMSCs 中的小圆细胞数量较多。分离后的小圆细胞生长速度较慢(与文献报道相比),并且 所获得的细胞数目也较少;进行有限稀释后的BMSCs在%孔板中,小圆细胞可转 化为梭形细胞及扁平状细胞,梭形细胞可转化为扁平状细胞。(2)在诱导剂中加入 因子后,诱导出的神经元样细胞的漂起、死亡时间延后,免疫细胞化学染色表达GEAP 阳性、NsE阳性.用50p创刘AA诱导时,细胞形态学变化较慢,一般7小时左右 才出现胞体收缩现象;而用1 00一200 p g/m功六诱导时,3个小时小圆细胞就表现为明 显的神经元样细胞的形态,但是其凋亡的速度也较快,而扁平状细胞的变化较慢; 用SO0p创mlAA诱导时,细胞变化速度更快。免疫细胞化学染色表达NF阳性、G曰J 阳性。加入终浓度为20%的血清可使BH九心MSO处理后分化的细胞恢复成BMScs 原有的形态。在颅咽管病人脑脊液中BMScs的分化速度较快,并且发生改变的程度 较大,而在脑外伤积水的病人脑脊液中BMSCs的分化速度相对较慢,并且发生改变 的细胞数没有前者多。免疫细胞化学染色NSE呈弱阳性,NF呈弱阳性、用HPLC 法可检测出诱导液中含有单胺类递质。(3)治疗4周后,与DMEM组相比,未诱 导的BMSC口D侧[EM组、诱导的BMSCs/DMEM组、BDNFIN下3组及诱导的 BMSC澎BD叫rF/N T-3组动物旋转次数均不同程度减少,而BMSCs/BD创rF加下3组及未 诱导的BMSCs组动物减少的尤为明显(P0 .05),其减少的百分率分别为100%, 78.70%,53.63%,100%。免疫组织化学鉴定表明:DMEM组,在纹状体内可见TH 阳性细胞,在MFB附近,可见TH阳性细胞呈族状分布;BD叫[F厅fF-3组,在注射灶 局部、皮层及纹状体内也可见TH阳性细胞呈族状分布,并且有些细胞已伸出突起, 突起部分也呈现TH阳性;诱导的BMSC澎DMEM组及诱导的BMSCSIBDNRNT-3 Il 于谈基质佃脸向种任佃她令化众对摘全森扁的始方 中英义摘要 组,在纹状体、皮层、MFB等区域内可见大量TH阳性细胞呈族状分布,在移植灶 中可见TH及Brdu双重阳性细胞及Nestin阳性细胞。未诱导的BMSCs心M旧M组, 在脑内也可见TH阳性细胞,但在移植灶中的TH阳性细胞数少于诱导的 BMSCs忍DNrF加T-3组。正常对照组中相应部位未见TH阳性细胞。 结论:(1) hBMSCs更适合在MesenCult培养基中生长,并且MesenCuh对扁平状细 胞有纯化作用。小圆细胞在各亚型细胞中是


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