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遗传性纤溶酶原激活剂抑制物-1缺乏症的诊断、治疗及发病机理的研究

张子彦  
【摘要】:研究背景:纤溶系统是止血功能的重要组成部分,参与血管再通及组织修复等过程,维持内环境的稳定。纤溶酶原激活剂抑制物-1(PAI-1)是纤溶系统的重要负调控因子,它通过与组织型(tPA)或尿激酶型(uPA)纤溶酶原激活剂形成1∶1的复合物,抑制纤溶酶的产生。遗传性PAI-1缺乏症是一种罕见的常染色体隐性遗传的出血性疾病,其病因是由于PAI-1的缺乏,其功能下降,导致纤溶系统失衡,造成纤溶亢进。典型的临床表现是:平时无自发性出血,在手术或外伤后出现延迟性出血,即可以有短暂的止血,但随后是持续不断的慢性渗血不止。我们在临床工作中发现一例遗传性PAI-1缺乏症患者,并对其发病机理进行了研究。 病史:患者,男,1970年生,自幼在皮肤破损后出血不止,愈合缓慢。在肢体碰撞后即出现血肿,经保守治疗后可逐渐消退,但无自发性皮肤粘膜出血。两年前因右大腿血肿而手术,手术期间与术后渗血不止,冷沉淀物与凝血酶原复合物无效,经大量输注血浆与全血后血止。一月前因外伤在左大腿及左臀部形成两个巨大血肿。患者父母为非近亲婚配,无家族史。 实验室检查:凝血过筛试验正常(APTT 38.9s,PT 14.9s,TT 15.3s,纤维蛋白原3.19g/L),出血时间7min,因子Ⅷ活性72.9%,因子Ⅸ活性96.1%,vWF抗原95.3%。血小板聚集试验正常(ADP 72%,肾上腺素60%,胶原88%,瑞斯托霉素82%)。优球蛋白溶解时间(ECLT)明显缩短,为70min(正常对照>120min),在血浆中加入生理浓度的PAI-1(50ng/ml)后延长至>120min。FⅩⅢ活性100%,D-二聚体和纤维蛋白(原)降解产物(FDP)正常。tPA活性0.33AU/ml(正常对照0.31AU/ml),tPA抗原20.4ng/ml(正常对照21.7/ml)。PAI-1活性为0.04 AU/ml(正常对照0.41AU/ml),PAI-1抗原5.6ng/ml(正常对照44ng/ml)。α_2抗纤溶酶(α_2 AP)活性127.7%(正常对照98.6%)。 诊断:患者具有典型的临床表现,多次测定凝血过筛试验及血小板功能检查均正常,而ECLT明显缩短,血浆中加入生理浓度的PAI-1后ECLT恢复至正常,血浆PAI-1活性和抗原均明显下降,tPA抗原和活性及α_2AP活性均正常,可明确诊断为PAI-1缺乏症。 治疗:血肿清除手术前开始给患者静滴抗纤溶药物氨甲苯酸0.4g,q8h,手术过程顺利,出血不多。术后剂量仍为0.4g,q8h,但左臀部仍有少量渗血,加大剂量至0.5g,q6h,渗血逐渐停止。 遗传性纤溶酶原激活剂抑制物一1缺乏症的诊断、治疗及发病机理的研究中文提要 发病机理研究:(1)测序云为进一步探讨造成患者血浆PAI一1下降的机理,明 确患者基因是否有异常改变,扩增患者PAI一1基因各外显子DNA,PCR产物多次直 接测序结果与GenBank人R叼一1基因序列对比,均发现第4497位(外显子2的43 位)有G~A的杂合性改变,该突变导致信号肤的巧位丙氨酸(GCC)突变为苏氨 酸(Acc);将PcR扩增产物连接至pucm一T载体,挑取单克隆双相测序亦证实 存在该突变。(2)限制性内切酶PshAI酶切鉴定:该突变产生了内切酶PshAI的酶 切位点,患者和其父亲为杂合子,其余家庭成员和60例正常人PCR产物不能被酶 切,排除了该突变为基因多态性的可能。(3)从人脐静脉内皮细胞中扩增PAI一1 mRNA,逆转录为cDNA,构建cDNA全长表达质粒野生型pPAI”w及含G4497A的突 变型质粒pPAI一’M4,,并瞬时转染中国仓鼠卵巢(C HO)细胞。ELIsA法和发色底物法分 别测定转染细胞培养上清PAI一1抗原和活性,免疫印迹分析胞浆中PAI一1蛋白表达。 结果:PAI一l抗原:野生型186.03ng/ml,突变型135.84ng/ml,对照2.67士z.95ng/Inl: 队I一1活性:野生型2.69AU/ml,突变型1 .82AU/ml,对照0 AU/ml。PAI一1抗原和活 性在野生型均大于突变型,而胞浆中PAI一l蛋白表达量无明显差异。 讨论:PAI一1信号肤长23个氨基酸,本例患者信号肤巧位的氨基酸突变位于 疏水区,其周围为几个连续的疏水性氨基酸,丙氨酸为疏水、非极性氨基酸,苏 氨酸为亲水、极性氨基酸,当突变为苏氨酸时,其极性改变,可能影响了信号肚 的正常功能,从而影响了PAI一1蛋白在胞内的运输和分泌。为进一步探讨该突变在 发病中的作用,我们构建了表达PAI一1 cDNA全长的野生型及突变型质粒,并将其转 染至CHO细胞进行瞬时表达,发现在培养上清中突变型PAI一1抗原及活性较野生型 减低,约为70%,而胞浆中PAI一1蛋白含量一致,表明信号肤的突变在一定程度上影响 了蛋白的分泌过程。遗传性PAI一1缺乏症是常染色体隐性遗传性疾病,患者应为纯 合子或双重杂合子。本例患者的父母为非近亲婚配,患者的PAI一1基因4497位G ~A突变来自于父亲。患者信号肤的突变为杂合性改变,故推测还应存在另一杂合 性突变,或者其他因素影响到蛋白表达。


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