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DC-白血病细胞融合及白血病细胞冻融抗原负载DC诱导特异性T细胞应答的比较

盛立霞  
【摘要】:目的:比较树突状细胞(DC)与白血病细胞融合及白血病细胞冻融抗原负载DC两种白血病DC疫苗诱导抗原特异性CTL应答的能力,旨在寻求DC白血病疫苗的最佳抗原负载方案,为设计安全、高效的DC疫苗提供实验依据。 方法:取健康志愿者外周血200mL,肝素抗凝,采用羟乙基淀粉-Ficoll两步法分离获得单个核细胞(PBMC),用RPMI1640洗4~5次去除血小板,用10%FBS-RPMI1640调整细胞的密度为2×10~9/L,接种于24孔培养板中,37℃、5%CO_2培养箱中孵育2h后,洗去非贴壁的细胞(培养CTL用),收集贴壁的细胞用含rhGM-CSF(8×10~5IU/L)、rhIL-4(8×10~5IU/L)的完全培养基在37℃、5%CO_2培养箱中培养,每3d半量换液并补充新鲜的细胞因子,于培养的第5天,将DC分成4组:A组(融合组),将DC与K562细胞或原代慢性粒细胞白血病(CML)细胞在500g/L PEG-100mL/L DMSO诱导下融合;B组(冻融抗原负载DC组)加入相应细胞数量的白血病细胞冻融抗原;C组(共培养组),将K562细胞或CML细胞与DC共培养:D组为未负载抗原的单独DC培养组。部分K562细胞先标记上红色荧光染料PKH26再与DC融合,采用流式细胞仪(FCM)检测PKH26/FITC-抗HLA-ABC抗体双标细胞并评估融合率。于培养的第6天,加入TNF-α诱导DC成熟,于第8天将各组细胞分别与自体T细胞共培养5d,用MTT比色法检测各组自身混合淋巴细胞反应,并以K562或CML细胞的冻融抗原负载的自体DC作为靶细胞,MTT比色法检测各组CTL的MHC限制性抗原特异性杀伤作用。 结果:GM-CSF加IL-4和TNF-α依次诱导成熟的DC具有经典的形态特征,并表达DC的特性标记CD83和CD1a,同时可表达高水平的CD80、CD86等共刺激分子及HLA-DR。在倒置显微镜下可见在融合剂PEG-DMSO的介导下,部分K562细胞与DC先发生细胞膜融合,形成双核或多核的细胞,然后,细胞胞核也逐渐发生融合,形成K562细胞与DC的杂交细胞。在PEG-DMSO作用下,白血病细胞与DC杂交细胞的形成率在(17.33~29.94)%。在S∶R为1∶50时,A、B、C及D组对T细胞的刺激指数(S1)分别为3.12±0.11、3.16±0.12、3.18±0.10和3.08±0.03(P0.05),而FCM检测发现,冻融抗原负载组及融合组扩增的自身淋巴细胞中CD8~+Tc细胞的比率可明显增加,分别由诱导前的(32.63±4.76)%升至(63.25±6.23)%和(69.32±5.69)%;


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