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野桑蚕细胞色素P450基因的研究

陈玉华  
【摘要】:细胞色素P450单加氧酶系是一种广泛分布于各种需氧生物体内的氧化酶系,由多种成分组成。很多证据表明,昆虫细胞色素P450 酶系介导的代谢抗性是大多数昆虫产生抗性和对寄主植物适应性的主要机制。 以氟化物诱导的野桑蚕中肠组织为基础材料,根据家蚕CYP305B1 基因序列设计特异性引物,通过RT-PCR 分两段扩增了野桑蚕的CYP305B1V1cDNA 基因; 通过拼接获得了完整CYP305B1V1 基因。测序结果显示,野桑蚕CYP305B1V1 基因的ORF 为1464nt,编码487aa,具有细胞色素P450 蛋白的共同特征。同源性分析表明,在DNA 水平上,野桑蚕CYP30581V1 基因与家蚕CYP30581 基因的同源性达99%,而推导的氨基酸序列则完全一致。通过NCBI 中家蚕基因组数据库查询、比对和拼接, 预测野桑蚕CYP30581V1 基因结构中至少含有7 个内含子,且内含子一外显子之间的连接符合GT-AT 法则。 将CYP30581V1 的cDNA 序列克隆进原核pET28a(+),构建了原核表达质粒,再转化到大肠杆菌BL2l 细胞中,通过IPTG 诱导表达。SDS-PAGE、westeron blotting 分析表明,带有His6 标签的重组CYP30581V1 蛋白的分子量为57kDa 左右,与理论值相符。为通过纯化蛋白,进一步构建细胞色素P450 的体外代谢体系奠定了基础。 抽提不向条件下野桑蚕的各组织总RNA,利用DIG 标记的随机引物制备了野桑蚕CYP30581 VlcDNA 探针,通过点杂交的办法尝试进行了CYP30581V1 基因表达的组织特异性研究。初步结果显示,CYP30581V1 基因在氟化物诱导的野桑蚕中肠、脂肪体、 马氏管、体壁中有特异性转录。


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