携带人CTLA4-Ig基因和FasL基因的非增殖腺病毒载体的构建及其诱导大鼠同种异体肾移植免疫耐受的实验研究

【摘要】：目的:(1)构建携带人CTLA4-Ig 基因的重组非增殖腺病毒载体质粒pAdTrack-CMV-hCTLA4-Ig 和携带人FasL 基因的重组非增殖腺病毒载体质粒pSuCMV-FasL;(2)重组非增殖腺病毒载体质粒pAdTrack-CMV-hCTLA4-Ig 和重组非增殖腺病毒载体质粒pSuCMV-FasL 体外转染人胚肾293 细胞内,以观察CTLA4-Ig 和FasL 蛋白表达情况;(3)建立SD→Wistar 系大鼠同种异体原位肾移植模型;(4)将CTLA4-Ig 基因和FasL 基因,在冷保存时经供肾动脉局部灌注转染至供肾体内,观察其对肾移植大鼠生存期的影响,并探讨转CTLA4-Ig 基因和Fasl 基因的转基因治疗诱导大鼠肾移植免疫耐受的可能机理。 方法:(1)将含有hCTLA4-Ig 基因的质粒pGEM3ZF-hCTLA4-Ig 质粒经HindⅢ、XbaⅠ双酶切后,获得人全长CTLA4-Ig cDNA,将该片段与同样经HindⅢ、XbaⅠ双酶切的非增殖腺病毒载体pAdTrack-CMV 在DNA 连接酶作用下进行连接反应,将连接产物转化DH5α大肠杆菌感受态细胞,PCR 筛选阳性克隆,命名为pAdTrack-CMV-hCTLA4-Ig。(2)以含有人Fas Ligand 全长cDNA 序列的质粒J28-FasL 为模板,以PCR 方法获得全长FasL cDNA,将该片段与经NheI、SalI 双酶切的非增殖腺病毒载体pSuCMV 在DNA 连接酶作用下进行连接,将连接产物转化DH5α大肠杆菌感受态细胞,PCR 筛选阳性克隆,命名为pSuCMV-FasL。上述两个载体用PCR 及RT-PCR 方法检测是否有CTLA4-Ig 基因或FasL 基因整合及mRNA 的表达,并测序检测。(3)将pAdTrack-CMV-hCTLA4-Ig 和pSuCMV-FasL在体外分别转染人胚肾293 细胞株,用RT-PCR 检测其mRNA 表达,Westarn blot检测其蛋白表达。(4)“袖套法”建立大鼠同种异体原位肾移植模型,并进行技术改进。行供体为SD 大鼠、受体为Wistar 大鼠肾移植,随机分为4 组:A 组(空白对照组),不作任何治疗;B 组(空载体对照组):冷保存时感染Ad-EGFP(1.0X10~9pfu/ml);C 组(Ad-CTLA4-Ig 治疗组):冷保存时感染Ad-CTLA4-Ig(1.0X10~9pfu/ml);D 组(Ad-CTLA4-Ig+Ad-FasL 治疗组):冷保存时感染Ad-CTLA4-Ig (1.0X10~9pfu/ml)和Ad-FasL(1.0X10~9pfu/ml)。肾移植术后抽取外周血及移植肾,检测肾功能,ELISA 法检测血清IL-2、IL-10 及IFN-γ的浓度,免疫组化法检测移植肾组织CTLA4-Ig 和FasL 的表达,TUNEL 法检测移植肾淋巴细