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抗血小板胶原受体糖蛋白VI单克隆抗体的制备和功能研究

余自强  
【摘要】:血栓性疾病严重威胁人类健康。动脉血栓形成常导致相应脏器功能衰竭。研 究血栓形成机制及探索抗血栓治疗方法是重要的研究方向。在动脉血栓形成中血 小板发挥重要作用,血小板通过其表面膜糖蛋白(如GPⅠb-Ⅸ-Ⅴ,GPⅡb-Ⅲa,GPⅥ, GPⅠa-Ⅱa)与损伤后暴露的血管内皮下胶原发生粘附,继而在损伤部位形成血小板 凝块、促进凝血发生、导致血栓形成。由此可见,在血栓形成的起始阶段,血小 板与胶原的有效粘附是不可缺少的先决条件,抑制血小板粘附功能将产生显著的 抗血栓功效。新型抗血栓药物Abciximab阻断GPⅡb-Ⅲa与纤维蛋白原结合而发挥 抗血栓作用,但也存在引起严重出血的潜在危险。近年来,抗粘附治疗作为新的 抗血栓手段已引起广泛关注,通过抑制GPⅠb—vWF—胶原轴和GPⅥ/GPⅠa-Ⅱa—胶 原轴阻断血小板与胶原的粘附,即在早期阶段阻止血小板的粘附、活化,可能起 到更好的抗血栓形成作用,并可减少出血的危险性。在高剪切力条件下,血小板 与胶原粘附依赖胶原受体GPⅥ、GPⅠa-Ⅱa,和间接胶原受体GPⅠb-Ⅸ-Ⅴ。而血小板 粘附后的活化过程主要由GPⅥ所介导。GPⅥ是血小板重要的胶原受体,生理状 态下,GPⅥ与FcR γ链形成异源二聚体,共同发挥信号转导作用。GPⅥ基因剔 除或抑制GPⅥ功能均可特异性地阻止血小板与胶原的粘附和聚集,对正常止血功 能影响小。因而,GPⅥ成为抗粘附及抗血栓治疗的新靶点,GPⅥ功能抑制剂有 望成为新的抗血栓药物。 基于上述GPⅥ在血栓形成中的重要性,我们开展了GPⅥ功能研究及抗GPⅥ 单克隆抗体的研制工作,以探索抗血栓治疗的新途径。采用基因重组技术克隆了 GPⅥ胞外区基因片断,并在原核细胞中成功表达。以重组蛋白为抗原免疫小鼠, 采用细胞融合和单克隆筛选技术制备了抗GPⅥ单克隆抗体;同时利用分子生物学 技术克隆了该抗体的重链可变区和轻链可变区基因片断,经连接子连接后制备了 单链抗体,并在原核细胞中表达。利用血小板聚集试验和流式小室技术观察了该 单抗和单链抗体对胶原诱导的血小板聚集,以及对血小板与胶原表面粘附的抑制 情况。 一、以含GPⅥ全长cDNA质粒pBluescript KS(-)-GPⅥ为模板,采用PCR方 法扩增GPⅥ胞外区片断cDNA序列,构建了表达载体pET-20b(+)-GPⅥ,转化 大肠杆菌BL21(DE3)pLysS,经IPTG诱导表达目的蛋白。12%SDS-PAGE分析


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