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基质金属蛋白酶-2的基础与临床研究

胡晓慧  
【摘要】:基质金属蛋白酶-2 (MMP-2) 是由Huhtala P.等人在1990 年克隆表达的,其结构中含有信号肽、前肽、催化区、纤维连接蛋白样区域及血红素结合样区域。人类MMP-2基因编码分子量约72kd 的酶原,经活化后水解为65kd 的活性形式。MMP-2 是降解细胞外基质骨架蛋白Ⅳ型胶原主要酶之一,其生理功能主要是参与伤口愈合,生殖以及生殖器官的复旧等。研究发现MMP-2 与肿瘤的侵袭和转移、自身性疾病自身免疫性疾病、牙周疾病以及肿瘤组织的血管生成密切相关。鉴于MMP-2 的重要病理生理功能,本研究旨在基础和临床两方面对MMP-2 的功能作进一步探讨。通过在体外表达MMP-2 所特有的结构域,我们制备出抗MMP-2 的特异性单克隆抗体, 利用所制备的单克隆抗体初步建立了检测血清/浆MMP-2 水平的试剂盒,并且对正常人及良恶性肿瘤病人血清MMP-2 水平进行了测定和比较,这为检测MMP-2 提供了一个有效的工具;运用RNA干扰(RNAi)技术对MMP-2 基因进行基因沉默,更进一步揭示了MMP-2 的功能及可能的作用机制;同时对基质金属蛋白酶在慢性粒细胞性白血病,这一特殊类型的肿瘤中的作用进行了初步探讨。 1. MMP-2 单克隆抗体制备及功能研究 目前发现的基质金属蛋白酶所有成员的结构中都含有三个共同的结构域:1 催化区2 氨基端3 羧基端。此外基质金属蛋白酶-2(MMP-2)还有一个特有的区域,即纤维连接蛋白样区域,研究认为它所参与形成的空间结构决定MMP-2 与底物的连接,只有首先与底物连接,进而才可能发挥酶的活性作用。因此,这一环节的阻断,对抑制内皮细胞和肿瘤细胞的侵袭和转移等有重要意义。 我们根据GenBank 中MMP-2cDNA 序列设计引物,体外培养EA hy926 内皮细胞,收集细胞后抽提总RNA,利用所合成引物经RT-PCR 获得纤维连接蛋白样片段cDNA,与pET20b(+)表达载体重组后转化大肠杆菌BL21(DE3)plus,挑选阳性克隆后,经IPTG诱导表达蛋白。蛋白经次氮基三乙酸镍琼脂糖(Ni-NTA agarose)柱纯化浓缩后免疫Balb/c 小鼠,尾静脉加强后取脾细胞融合,ELISA 法筛选阳性克隆,制备腹水。运用Western blot 对抗体进行鉴定,并观察抗体与天然MMP-2 及纯品的反应情况, 进行亚型鉴定,组织特异性鉴定同时进行功能实验:增殖实验、侵袭实验以及体外血管新生实验。结果显示:原核表达MMP-2 纤维连接蛋白样片段大小为21kd,表达量占菌体总蛋白25%,经Ni-NTA agarose 柱纯化后,获得了部分纯化的蛋白。小鼠脾细胞与杂交瘤细


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