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人羊膜细胞在创伤性脑损伤中应用的实验研究

卢奕  
【摘要】:【目的】:创伤性脑损伤(traumatic brain injury,TBI)发病率高,但传统治疗方法疗效有限。人羊膜细胞(human amniotic cells,HACs)具有多潜能性、移植后不会诱导免疫排斥反应、有足够的细胞来源,还可表达神经细胞特异标记,分泌神经营养因子。本实验拟将HACs 置于创伤性脑组织提取液的条件培养基中探究HACs 在体外模拟创伤性脑损伤微环境下的分化和增殖情况,并用HACs 和表达胶源性神经生长因子(glial cell line-derived neurotrophic factor, GDNF)的HACs 靶点移植于大鼠TBI 模型以探究二者分别对TBI 大鼠运动功能和海马神经元的影响。 【方法】:取无并发症剖宫产羊膜,剥离羊膜1 小时内用0.25%胰酶反复消化三次提取HACs,接种后48h 去除未贴壁的HACs。采用Feeney 法制作大鼠TBI 模型,TBI24h后制备创伤性脑组织提取液。将HACs分别接种于RPMI1640培养基(1640)、RPMI1640 培养基与正常脑组织提取液(1640+NB)、RPMI1640 培养基与创伤性脑组织提取液(1640+TBI)3 组。共培养7 天后倒置相差显微镜检测各组细胞形态。共培养前后分别行Nestin 和MAP2 单抗免疫组化检测。将HACs 以10000/ml 和100000/ml 两种密度分别接种上述3 种培养基,培养1 天、4 天、7 天后经酶联免疫检测仪行四氮唑盐(MTT)比色法检测。Hoechst33342 标记HACs 重悬调整细胞浓度为10~5/μl;采用Feeney 自由落体法打击大鼠脑皮层后肢运动区域,使损伤皮层对侧后肢运动功能受损。损伤后24h 经微量注射器和立体定向仪将Hoechst33342 标记的HACs 10μl 分别移植于挫伤灶中心和挫伤灶边缘。实验分治疗组(TBI+HACs)、对照组(TBI+PBS)和假TBI 组3 组。在TBI 后的28 天内采用钉板平衡木行走测试评估损伤皮层对侧后肢运动功能变化。运动功能检测结束后经心脏灌注4%多聚甲醛后取出脑组织制成切片后分别行荧光显微镜检测、HE 染色和MAP2 免疫组化染色检测。采用Feeney 法撞击部位以前囟人字缝中点矢状缝左侧2mm 为中心制作TBI 致海马神经元损伤模型。TBI24h 后各组于挫伤灶边缘,每处距硬脑膜4mm 和2mm 两点移植,共5μl 含5×10~5个细胞。TBI+GDNF 组移植表达GDNF 的HACs;TBI+eGFP 组移植表达eGFP 的HACs;TBI+PBS 组注射5μlPBS;假TBI 组不移植。移植7 天后开始每天行Morris 水迷宫定位航行试验。移植后12 天空间搜索试验结束后一部分取出脑组织检测损伤侧海马变化,一部分取移植靶点区域脑组织行RT-PCR 检测GDNFmRNA


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