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胰岛素样生长因子-1基因强化组织工程法诱导裸鼠异位软骨形成的实验研究

张爱国  
【摘要】:目的:利用条件培养基诱导人骨髓基质干细胞(hMSCs)向软骨细胞分化,运用基因重组技术将人胰岛素样生长因子-1(IGF-1)基因转染修饰诱导后的人骨髓基质干细胞(hMSCs),测定IGF-1的表达情况,再将转染有IGF-1的hMSCs与再生丝素膜复合培养,植入裸鼠体内以观察诱导异位软骨形成的能力,以基因强化组织工程手段,尝试新型软骨组织工程材料,为临床软骨修复提供新的治疗方法。 方法: 1、梯度离心法分离培养hMSCs,体外贴壁培养扩增,在倒置显微镜下观察其形态、生长增殖情况以及诱导成软骨能力等特性,并通过流式细胞仪测定细胞表型,免疫组化检测软骨细胞表型。 2、以RT-PCR方法克隆扩增出hIGF-1基因片段,以核酸内切酶NheI和BamHI双酶切,与pSec Tag/FRT/V5-His质粒载体相连接并测序,构建pSec Tag/FRT/V5-His-hIGF-1的真核表达载体系统,利用脂质体介导转染中国仓鼠卵巢细胞(CHO),Western blot检测转染细胞hIGF-1的表达,MTT检测细胞上清对hMSCs增殖的生物学活性。 3、利用pSec Tag/FRT/V5-His-hIGF-1的真核表达载体系统,以脂质体介导转染诱导后的hMSCs,通过对转染细胞的RT-PCR、EIA和免疫组化的检测,了解诱导后的hMSCs稳定表达hIGF-1以及Ⅱ型胶原表达情况。 4、将转染后稳定表达hIGF-1并表达Ⅱ型胶原表型的hMSCs与生物组织材料再生丝素膜复合培养,扫描电镜观察细胞在支架上的形态,并将其复合物植入到裸鼠的皮下,一月后取材,HE及免疫组化观察其诱导软骨形成情况。 结果: 1、梯度离心法能分离培养出较为纯化的hMSCs,细胞大都呈梭形贴壁生长,体外培养具有快速增殖以及诱导向软骨分化的能力,流式细胞仪测定其细胞表型结果符合


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