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人CXCR4转基因细胞的构建与单克隆抗体的研制及其生物学功能的研究

周时勇  
【摘要】:CXCR4(CD184)分子属趋化因子家族,人CXCR4基因由由Feng等人于1996年发现并命名为Fusin,后来又被称为LESTR或HUMSTR,人CXCR4基因位于染色体2q21区,编码由352个氨基酸组成的蛋白质,是高度保守的7次跨膜受体。CXCR4通过与其唯一的配体SDF-1α构成SDF-1α/CXCR4反应轴而发挥生物学功能。CXCR4分子具有广泛的表达谱,主要表达在外周血的CD26lowCD45RA+CD45RO-T淋巴细胞,B淋巴细胞,树突状细胞,内皮细胞和巨核细胞表面。CXCR4分子在免疫细胞、造血细胞的迁移和归巢中发挥重要的调节作用,而且参予神经系统的发育、血管发生、组织损伤修复和再生等。近年来许多研究发现大多肿瘤细胞也表达CXCR4,且肿瘤细胞表达CXCR4与其向组织侵润和转移相关。随着CXCR4分子的生物学功能和信号传导的分子机制的进一步研究,使其成为一个理想的生物干预靶分子,针对CXCR4分子的阻断剂将有更广阔的临床应用前景。因此,CXCR4转基因细胞的构建、CXCR4分子拮抗剂的研制及其在SDF-1α/CXCR4信号传导中的阻断作用的研究将为肿瘤的治疗提供有力的途径。 1.人CXCR4基因的克隆及转基因细胞的构建 本研究通过RT-PCR方法,从人外周血单个核细胞(PBMC)的总RNA中扩增出编码人CXCR4全长的cDNA片段,通过基因克隆技术,将其插入逆转录病毒载体pEGZ-Term。进一步采用脂质体转染技术将重组表达载体与辅助病毒载体共转染包装细胞293T,用其培养上清感染L929细胞72h后,经Zeocin筛选出稳定表达CXCR4分子的L929细胞株(L929/CXCR4)。经体外长期传代和液氮反复冻存和复苏,转基因细胞生长良好,并稳定表达CXCR4。构建的L929/CXCR4转基因细胞能在SDF-1α作用下介导迁移。 2.分泌鼠抗人CXCR4单抗的杂交瘤细胞株的制备 利用上述构建的转基因细胞L929/CXCR4为免疫原,免疫BALB/c小鼠,采用B淋巴细胞融合技术,将反复免疫后的小鼠的脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行细


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