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骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠肝功能衰竭的初步研究

吴绍宏  
【摘要】: 第一部分大鼠骨髓间充质干细胞分离、培养及CXCR4表达的初步研究 背景骨髓间充质干细胞(MSCs)在细胞疗法治疗多种组织损伤性疾病具有广阔的应用前景;基质细胞衍生因子-1α与其受体CXCR4结合后形成的SDF-1α/CXCR4轴是促进MSCs向损伤组织归巢的重要生物轴。我们的前期研究发现:1.肝功能衰竭患者在肝组织与外周之间存在有助于MSCs向肝脏归巢的SDF-1α浓度梯度。2.CXCR4在正常条件培养的人MSCs表面仅有低表达,但采用肝衰患者血浆、LPS、IL-6等干预培养后CXCR4的表达明显提高。因此,体外诱导MSCs胞膜CXCR4表达,提高MSCs移植的归巢效率,将为细胞疗法治疗肝功能衰竭提供新的思路,目前尚未见到相关研究报道。 目的分离、培养大鼠骨髓间充质干细胞;并研究肝衰竭大鼠血浆、LPS、IL-6和TNF-α等干预因素对大鼠MSCs细胞膜CXCR4表达的影响。 方法采用全骨髓贴壁筛选法分离培养大鼠MSCs,并进行成脂诱导鉴定;然后分别采用肝功能衰竭大鼠血浆、LPS、IL-6和TNF-α等干预培养MSCs,正常大鼠血浆和培养基作为对照,应用流式细胞技术检测各组MSCs胞膜CXCR4的表达。 结果大鼠MSCs呈梭形,漩涡状方式生长,成脂诱导后油红染色可见细胞浆内存在大量脂滴。肝功能衰竭大鼠血浆、TNF-α、IL-6、LPS干预培养后MSCs胞膜的CXCR4表达率分别为59.46±1.04%、56.34±0.89%、51.34±0.85%和44.66±0.36%,与正常培养组(26.76±0.27%)比较均存在显著性差异(P0.05);正常大鼠血浆干预组与正常培养组比较无统计学差异(27.13±0.67% VS 26.76±0.27%,P0.05)。 结论采用全骨髓贴壁筛选法可以成功分离培养出大鼠MSCs;肝衰竭大鼠机体内环境可以诱导MSCs胞膜CXCR4的表达,TNF-α、IL-6、LPS是该过程的重要因素。 第二部分骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠肝功能衰竭的初步研究 背景大量研究证实,MSCs移植对于心肌梗死、中枢神经损伤、糖尿病以及多种肝脏疾病具有明显的治疗作用,MSCs移植归巢效率是影响疗效的关键。SDF-1α与其受体CXCR4结合后形成的SDF-1α/CXCR4轴是促进MSCs向损伤组织归巢的重要生物轴。虽然肝功能衰竭患者在肝组织与外周之间存在有助于MSCs向肝脏归巢的SDF-1α浓度梯度,但是正常条件培养的MSCs胞膜仅低表达CXCR4。我们的前期研究发现肝功能衰竭血浆、TNF-α、IL-6、LPS等干预因素可以显著提高人及大鼠MSCs表面CXCR4的表达。因此采用上述干预因素体外诱导MSCs胞膜CXCR4的表达,提高MSCs移植的归巢效率,是MSCs移植治疗重型肝炎的一种新思路。 目的采用急性肝功能衰竭大鼠血浆诱导培养出CXCR4高表达的MSCs,然后移植治疗肝衰竭大鼠,并且与模型对照组及正常MSCs移植组进行比较,观察各组肝衰竭大鼠的肝功能、生存率及MSCs的归巢情况,研究CXCR4表达对MSCs归巢效率及治疗效果的影响,进一步提高MSCs移植治疗重型肝炎的疗效。 方法采用D-gal腹腔注射的方法制作大鼠肝衰竭模型;按第一部分的方法从大鼠骨髓中分离培养出CXCR4高表达(采用肝功能衰竭大鼠血浆干预培养)及正常表达的MSCs,并利用Brdu进行标记;将两组细胞经尾静脉移植治疗大鼠肝功能衰竭模型各10只,并且与模型对照组(n=8)进行比较,持续观察并记录3组大鼠一般状况、生存率等情况,动态检测肝功能及肝脏病理变化,免疫组织化学检测MSCs归巢至肝脏的情况。 结果Brdu标记的MSCs染色后可见细胞核内有大量棕褐色阳性反应物;细胞标记效率达92±2.3%。造模后大鼠逐渐进入肝衰竭状态,表现为拒食,活动明显减少,萎靡、嗜睡或逐渐发展为昏迷状态,对外界刺激反应较迟钝,全身毛蓬松,尿失禁,尿色深黄;生化检查发现肝功能严重损害,组织学检查显示肝细胞大片坏死、大量炎性细胞浸润。从移植术后3d开始,实验组和移植对照组存活大鼠一般情况比模型对照组好转更加明显,肝功能(P0.05)及肝脏组织学改善,其中实验组肝功能比移植对照组好转更加明显,术后7d时ALT指标与移植对照组比较具有统计学差异(P0.05)。但各组间生存率最终无统计学差异(P0.05)。术后1w,采用免疫组织化学的方法可以在实验组及移植对照组大鼠肝脏中检测到归巢的MSCs细胞,实验组多于移植对照组(8.5±3.4 VS 4.5±3.2个/400倍视野,P0.05),其中移植对照组主要集中分布门静脉及汇管区周围或滞留在血管内,而实验组分布较为广泛,在肝脏实质中呈弥漫性分布。 结论骨髓间充质干细胞(MSCs)经尾静脉同种异体移植,可以归巢到肝衰竭大鼠肝脏,能够促进急性肝衰竭大鼠肝功能的恢复,减轻肝脏组织炎症坏死,促进肝脏组织修复,对急性肝功能衰竭具有明显的治疗作用。采用肝衰竭血浆模拟肝功能衰竭大鼠特殊内环境,能够诱导MSCs表面CXCR4的表达,移植后具有更强的归巢能力和治疗作用。


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