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hGM-CSF基因活体电转染救治小鼠放射损伤的实验研究

王天昶  
【摘要】: 目的:粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte-Macrophage Colony stimulating factor,GM-CSF)具有刺激造血干细胞和祖细胞向髓系分化、增殖和成熟的功能,在急性放射损伤救治中已经成为一种较为有效的细胞因子药物。但由于细胞因子具有生物半衰期短、副作用大、用量不易控制等缺点,在一定程度上限制了GM-CSF所能发挥的治疗作用。本实验利用活体基因电转导技术,将hGM-CSF基因转入小鼠体内,探索一种新的转基因救治放射损伤的技术。材料与方法:采用PCR方法将目的基因从原核载体中扩增出来,并通过修改基因两端限制性酶切位点,将目的基因插入真核表达载体pEGFP-N1中,构建真核表达载体pEGFP-N1-hGM-CSF。使用活体基因电转导,将重组质粒转入小鼠局部肌纤维细胞,使其有效持续表达hGM-CSF蛋白。转基因组与单纯照射组小鼠应用γ射线与中子线照射,观察小鼠急性放射损伤的死亡率、血细胞数目、骨髓细胞以及胸腺、脾脏淋巴细胞增值率和凋亡率,肝脏、肾脏以及睾丸的病理变化,探讨hGM-CSF活体转基因在救治急性放射损伤中的作用。 结果:经测序表明,构建的真核表达质粒pEGFP-N1-hGM-CSF cDNA序列与Gene Bank序列一致。活体基因电转导效率明显增高。在急性γ射线损伤中,hGM-CSF转基因组小鼠较单纯照射组小鼠死亡数量明显减少,白细胞总数均显著高于对照组(p0.05),至照后28d时,白细胞已恢复至照射前水平;骨髓细胞增殖率亦显著高于对照组(p0.05),且一直处在一个相对较高的水平,约为对照组的80%-95%。转基因组小鼠肝脏和肾脏病理结果显示,组织充血、水肿、坏死程度均较单纯照射组轻微,恢复时间缩短。在急性中子射线损伤中,hGM-CSF转基因组小鼠与单纯照射组小鼠比较,死亡率明显降低;白细胞总数下降程度亦明显减轻(p0.05);骨髓细胞、脾脏和胸腺淋巴细胞凋亡率均降低(p0.05)。 结论: 1.成功构建真核表达质粒pEGFP-N1-hGM-CSF,该质粒可作为活体基因电转染的有效载体,具有较高的转染效率。 2.hGM-CSF活体基因电转染在小鼠急性γ射线损伤中可降低小鼠死亡率,减轻白细胞下降程度,提高骨髓细胞增殖活性,缩短肝肾组织病理损伤恢复时间,减轻病理损伤程度。 3.hGM-CSF活体基因电转染在小鼠急性中子射线损伤中可明显降低小鼠死亡率,显著降低骨髓细胞与脾脏、胸腺淋巴细胞凋亡率,对减轻白细胞下降有明显疗效。 4.hGM-CSF基因活体电转染为救治急性重度放射损伤提供了新的有效手段。


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