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环介导等温扩增检测弓形虫方法的建立及初步应用

葛海燕  
【摘要】: 目的:建立一种灵敏度高、特异性强、简单快速、低成本检测弓形虫DNA的方法。 方法:采用环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术建立了检测弓形虫DNA的方法,并进行特异性、敏感性评估,在此基础上建立依据SYBR Green I的定量方法及通过显色反应直接判断结果的简便方法。为验证我们建立方法的临床应用价值,最后用建立的方法对57例孕妇外周血标本进行了检测。 结果:通过对建立的LAMP扩增弓形虫DNA反应体系的优化,发现镁离子影响较大,其它如甜菜碱、温度等影响不大。特异性评估表明仅弓形虫检测阳性,而猪肉绦虫、血吸虫等寄生虫检测为阴性,酶切鉴定结果进一步证明了扩增的特异性。敏感性检测下限为每反应管10拷贝。以重组质粒制作的标准曲线显示,循环阈值与模板浓度有良好的线性关系,相关系数0.929,扩增效率0.961。对57例孕妇标本检测,发现2例阳性,定量检测值均约103拷贝/μl。 结论:本研究中建立的LAMP检测弓形虫基因组DNA方法,特异性强、敏感性高、简便快速且成本低,有望在临床检测中发挥一定的作用。


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