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可降解多孔型丝素蛋白/羟基磷灰石的制备及其修复骨缺损的实验研究

王根林  
【摘要】: 第一部分可降解多孔型丝素蛋白/羟基磷灰石的制备及其在SD大鼠体内降解的实验观察 【目的】制备丝素蛋白/羟基磷灰石(silk fibroin/hydroxyapatite,SF/HA)复合人工骨材料,并将该材料植入生物体内降解,以了解SF/HA在动物体内的降解速率及机体对SF/HA的组织学反应,为后续成骨实验提供可靠的参考数据。 【方法】以蚕丝丝素蛋白作为羟基磷灰石沉积的模板,以家蚕丝素短纤维为增强材料,以NaCl为致孔剂,采用等静压的方法制备4种SF/HA复合多孔材料。以羟基磷灰石为对照组,测定4种SF/HA复合材料及羟基磷灰石在0.5h、2h、6h、12h及24h不同时间点的吸水率。将4种SF/HA复合材料及羟基磷灰石植入SD大鼠背部皮下,进行体内降解观察。实验组分别于术后2、6、12、16、20及24周取材,对照组分别于术后2、12及24周取材,进行大体观察及组织学检查。 【结果】丝素蛋白、HA、添加剂及致孔剂配比不同,制备的4种SF/HA人工骨材料的孔径、孔隙率及强度等也不同。材料吸水率趋势如下:SF/HA_3、SF/HA_4SF/HA_2、SF/HA_1 HA。HA、SF/HA_1及SF/HA_2降解十分缓慢或基本不能降解;SF/HA_3 20~24周降解完毕;SF/HA_4 12~16周降解完毕;各种材料周围组织未见明显变性坏死等。 【结论】SF/HA_1平均孔径为6.5μm,最大孔径也只有15μm,不适合骨组织工程支架材料的要求。SF/HA_4虽然孔径、孔隙率满足要求,但力学强度较低,压缩强度只有1.59MPa,在水中很快散开,也不适合骨组织工程的要求。故在后续的试验中,我们剔除这两种材料,将对SF/HA_3及SF/HA_2两种材料进行体外细胞相容性研究。 第二部分兔骨髓基质细胞的分离培养及其成骨诱导分化的实验研究 【目的】体外分离培养兔骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs),并向成骨方向诱导培养,为SF/HA相容性提供检测细胞及为SF/HA组织工程化骨提供适宜的种子细胞。 【方法】抽取新西兰白兔的骨髓5ml,通过密度梯度离心法获取BMSCs,体外贴壁培养、扩增、传代,倒置显微镜下观察原代及各代细胞形态、数量生长情况,描绘生长曲线。第2代细胞用含1×10~(-8)g/l地塞米松、10mmol/lβ-甘油磷酸钠及50μg/l L-抗坏血酸的条件培养液将其定向成骨诱导培养、扩增。采用倒置相差显微镜观察细胞形态变化;采用MTT法测定细胞增殖情况;使用碱性磷酸酶染色及Von Kossa钙结节染色等方法,鉴定其成骨性能。 【结果】BMSCs在培养皿中贴壁生长、增殖,条件培养液诱导后表现出明显的成骨活性,细胞增殖良好,体外矿化结节Von Kossa染色阳性、碱性磷酸酶染色阳性,证实其有成骨潜能。 【结论】可以通过体外分离纯化兔BMSCs,在一定条件下能够向成骨方向诱导分化,并能使细胞保持较高的成骨活性,适于作为材料相容性的检测细胞及构建组织工程化骨的种子细胞。 第三部分可降解多孔型丝素蛋白/羟基磷灰石复合人工骨材料的细胞相容性研究 【目的】以成骨诱导的BMSCs作为检测细胞,与两种丝素蛋白/羟基磷灰石(SF/HA)进行体外复合培养,检测SF/HA的细胞相容性。 【方法】将兔BMSCs体外成骨诱导至第3代,接种到预湿的SF/HA_2及SF/HA_3材料上复合培养,以单纯BMSCs相同条件下培养作为对照。通过相差显微镜、扫描电镜及HE染色等方法观察细胞在材料中的生长情况。以MTT法检测材料对细胞增殖活性的影响,以碱性磷酸酶活性测定评价其成骨能力,以材料浸提液的细胞毒性试验评估材料是否有细胞毒性。 【结果】扫描电镜及组织学观察发现,细胞材料复合后,BMSCs在SF/HA_2及SF/HA_3上能够良好地粘附和增殖。ALP活性测定及MTT法测定OD值均证实,BMSCs细胞活性及成骨性能不受材料影响,与对照组相比,差异无统计学意义(P0.05)。材料浸提液细胞毒性试验显示,细胞毒性分级均为0~Ⅰ级,两种SF/HA浸提液对细胞生长基本无毒性作用。 【结论】SF/HA_2与SF/HA_3对BMSCs的生长和成骨功能无影响,具有良好的细胞相容性,具有构建组织工程化骨的可行性。 第四部分可降解多孔型丝素蛋白/羟基磷灰石异位成骨及其组织相容性的实验研究 【目的】探讨SF/HA_2及SF/HA_3体内异位成骨的能力,并通过肌肉植入实验进一步观察两种材料的组织相容性,为SF/HA修复节段性骨缺损提供实验依据。【方法】将体外诱导培养的兔骨髓基质细胞,以5×10~7/ml的密度接种到SF/HA_2,作为实验组1;接种到SF/HA3,作为实验组2,并于3~5d后植入兔背部肌肉中。植入单纯SF/HA_2与SF/HA_3,作为对照组。对照组亦作为材料的肌肉植入实验模型,观察组织相容性。于术后第4、8、12周,每次随机选取5只兔处死后取材,大体观察及HE染色组织学观察,并进行骨组织形态计量学分析,定量比较各组新骨形成情况。 【结果】实验组术后4、8、12周均有新骨形成,随着时间延长,新骨生成量增多;骨组织形态计量学分析显示,实验组1优于实验组2(P0.05);对照组则均无新骨形成。肌肉植入实验未见肌肉变性坏死等。 【结论】肌肉植入实验、第一部分的皮下植入实验及第三部分的细胞相容性研究均显示,两种SF/HA具有良好的组织相容性。SF/HA_3与SF/HA_2复合细胞后构建的组织工程化骨,具有良好的异位成骨能力,可望应用于临床修复骨缺损。但从生物降解性及异位成骨的效果看,SF/HA_3更适合于作为人工骨材料,将进一步研究该材料修复节段性骨缺损的能力。 第五部分可降解多孔型丝素蛋白/羟基磷灰石组织工程化骨修复节段性骨缺损的实验研究 【目的】探索SF/HA_3组织工程化骨的成骨作用及作为骨替代材料的可行性,期望为临床治疗骨缺损提供新的人工骨材料。 【方法】在本实验中将SF/HA_3更名为SF/HA,与诱导的兔BMSCs复合,构建组织工程化骨。麻醉生效后,充分显露兔左侧桡骨中上段,造成15mm节段骨缺损。实验组植入SF/HA+BMSCs复合物,实验对照组植入SF/HA材料,空白对照组骨缺损区不植入任何材料。 于术后第4、8、12及16周行X线摄片及16周时行螺旋CT扫描重建,观察骨缺损修复及骨塑形情况。参照Lane-Sandhu X线评分标准对各组桡骨缺损的骨修复程度评分。标本行HE染色及Masson染色组织学观察,按照Lane-Sandhu组织学评分法比较12周及16周时各组动物的骨修复情况。 【结果】实验组、实验对照组及空白对照组的放射学及组织学检查评分显示,新骨生成有统计学差异(P0.05),实验组优于实验对照组优于空白对照组;大体观察及放射学检查证实:实验组兔桡骨缺损完全愈合;实验组对照组缺损处少部分骨愈合;空白对照组缺损基本无骨修复作用,由纤维组织充填。 【结论】SF/HA与BMSCs复合,降解速率适宜,能较快被骨组织取代,具有相当于自体骨的骨缺损修复能力,基本达到现代骨组织工程学的要求。但材料本身缺乏骨诱导作用,单独用于节段性骨缺损修复作用有限。


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