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慢病毒介导的ICAM-1基因沉默治疗大鼠肾移植模型急性排斥反应的实验研究

潘浩  
【摘要】: 第一部分:大鼠同种异体肾移植模型的建立 目的:建立一种稳定、可靠、实用的大鼠同种异体肾移植急性排斥反应模型。 方法:1.采用移植肾置于左侧,供肾原位低温灌洗;移植肾带主动脉瓣与受体腹主动脉端-侧吻合;供体左肾静脉连其上方下腔静脉断端与受体下腔静脉端-侧吻合;供体输尿管带膀胱瓣与受体膀胱吻合。2.技术熟练后,行Wistar→SD大鼠肾移植,随机分为2组(每组12只):A组(排斥组),不作任何治疗;B组(CsA治疗组),术后使用CsA 10d。两组均行病理检查和观察生存期。 结果:1.经过3个月的练习,建立了比较稳定的大鼠同种异体肾移植模型。手术成功率可达到90%。2. A组平均存活7.33d;B组平均存活21.2d。术后7天病理检查示A组出现明显的急性排斥反应。 结论:此模型较容易掌握,除常规显微外科器械外不需要特殊的器械或设备。 第二部分:携带大鼠ICAM-1基因RNA干扰慢病毒载体的构建、体外鉴定与初步体内实验 目的:1.构建携带大鼠ICAM-1 RNA干扰的重组慢病毒。2.筛选出基因抑制效率最高的重组慢病毒。3.研究慢病毒载体体内转染主要脏器的有效性。 方法:1.根据基因序列,设计并合成针对4个靶点的寡核苷酸,制备双链DNA oligo;Hpa I和Xho I酶切pGCL-GFP载体以使其线性化,将其与双链DNA oligo在DNA连接酶作用下进行连接反应,将连接产物转化DH5α大肠杆菌感受态细胞,PCR筛选获得阳性克隆并进行基因测序。2.将重组载体与病毒包装质粒共转染人胚肾293 T细胞,获得的病毒颗粒经浓缩后测定滴度。3.通过重组慢病毒体外转染NRK细胞,以RT-PCR和Western Blot法筛选出基因抑制效率最高的重组慢病毒,并将其再次扩增、浓缩后测定滴度。4. SD大鼠静脉注射不同浓度重组慢病毒,分别于96小时、25天后检测报告基因表达情况。 结果:1.经过酶切、连接、转化后获得阳性克隆;基因测序结果完全正确。2.获得的针对4个靶点的重组慢病毒,经RT-PCR和Western Blot法证实,3#病毒在MOI=50时,基因抑制率即达到88.4%。3.大鼠体内实验表明,20×108 TU重组慢病毒可有效转染各主要脏器,转染25d后大鼠肾组织仍在不断表达报告基因。 结论:1.成功构建了含有GFP报告基因的大鼠ICAM-1 RNA干扰慢病毒载体。2.体外实验证实了该慢病毒载体能高效转导NRK细胞,并能有效阻断目的基因的表达。3.体内实验初步确定了该慢病毒载体的有效性。 第三部分:慢病毒介导的ICAM-1基因沉默治疗大鼠肾移植模型急性排斥反应 目的:1.研究携带大鼠ICAM-1 RNA干扰的重组慢病毒抑制移植肾ICAM-1基因表达的作用。2.探讨慢病毒介导的ICAM-1基因沉默防治大鼠肾移植模型急性排斥反应的作用效果和机理。3.初步探讨慢病毒载体结合RNA干扰应用于同种异体移植排斥的效果和前景。 方法:1.供体为Wistar大鼠、受体为SD大鼠肾移植,随机分为4组(每组12只):a组(同系对照组);b组(排斥组),不作任何治疗;c组(空白对照病毒组):供体术前96小时尾静脉输注空白对照病毒20×108 TU;d组(治疗组):供体术前96小时尾静脉输注rICAM重组慢病毒20×108 TU。2.肾移植术后观察生存期,并抽取外周血,检测肾功能,ELISA法检测血清IL-2、ICAM-1的浓度。3.肾移植术后7天取移植肾,RT-PCR和Western Blot法检测移植肾ICAM-1的表达;HE染色观察病理变化。 结果:1.肾移植术后治疗组生存期达23.8天,与b、c两组(仅为7.3、7.0天)相比有统计学差异。2.肾移植术后治疗组血清Cr、IL-2、ICAM-1的浓度与同系对照组相比无显著差别,而与b、c两组差别巨大。3.肾移植术后7天,治疗组移植肾ICAM-1表达明显被抑制。HE染色提示移植肾Banff 0~ⅠA级,而b、c组移植肾BanffⅡB-ⅢA级。 结论:1.携带ICAM-1 RNA干扰的重组慢病毒可以有效地、特异性地抑制移植肾ICAM基因的表达。2.被植入经rICAM重组慢病毒转染的供肾后,受体的生存期明显延长。3.慢病毒介导的ICAM-1基因沉默治疗大鼠肾移植模型急性排斥反应效果良好,具有潜在的应用价值。


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