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改良性大鼠同种异体肾移植模型的建立及环孢素A联合供体骨髓细胞输注诱导大鼠同种异体肾移植免疫耐受的实验研究

刘忠国  
【摘要】: 目的:(1)为开展肾移植的移植免疫研究,建立大鼠同种异体肾移植模型。(2)监测血清Th1/Th2细胞因子水平及其在移植肾组织中的mRNA表达在大鼠同种异体肾移植中的动态变化,研究其预测排斥反应与免疫耐受的价值。(3)监测CD4+CD25+T调节细胞(regulatory T cells,TR)在大鼠同种异体肾移植外周血中的动态变化,研究其在预测排斥反应和免疫耐受中的价值。(4)应用器官移植中最常用的免疫抑制剂环孢素A(Cyclosporin,CsA)联合供体骨髓细胞(donor bone marrow cells,DBMC)输注诱导大鼠同种异体肾移植免疫耐受,以探讨其诱导免疫耐受的机理并为临床肾移植工作提供实验依据。 方法:(1)Wistar大鼠为供体,SD大鼠为受体。采用左侧肾移植法,供体肾带瓣动脉与受体腹主动脉端-侧吻合,供体左肾静脉上方下腔静脉断端与受体下腔静脉端-侧吻合,供体输尿管带膀胱瓣与受体膀胱吻合。(2)ELISA测定血清中细胞因子IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10的表达水平;实时定量RT-PCR(Real- time quantitative reverse transcription PCR )监测IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10 mRNA在移植肾组织中的表达。(3)流式细胞术(flow cytometry,FCM)监测CD4+CD25+ TR细胞在大鼠同种异体肾移植外周血中的动态变化。(4)应用CsA联合DBMC输注诱导大鼠同种异体肾移植免疫耐受:观察生存时间(d);应用全自动生化分析仪检测移植肾受体血清肌酐(Cr)的动态变化;ELISA测定血清中细胞因子IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10的水平;实时定量RT-PCR监测IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10 mRNA在移植肾组织中的表达(术后7d);流式细胞术监测CD4+CD25+ TR细胞在外周血中的变化;单向混合淋巴细胞反应(MLR)了解免疫耐受的特异性;移植肾病理检查,判断排斥反应的程度。 结果:(1)建立了一种稳定、实用的改良性大鼠同种异体肾移植动物模型。肾静脉吻合时间平均(18±1.5)min,动脉吻合时间平均(15±1.0)min,总手术时间平均(135±22)min。热缺血时间5s,冷缺血时间40~45min。(2)Th1细胞因子IL-2、INF-γ在大鼠同种异体肾移植中,无论在血清中的表达水平或在移植肾组织中的mRNA表达水平与同系对照组及CsA组比较均显著升高,而与此对应Th2细胞因子IL-4、IL-10显著降低。(3)CD4+CD25+ TR细胞在大鼠同种异体肾移植急性排斥反应过程中明显低于同系对照组;而CsA组CD4+CD25+ TR细胞明显高于同系对照组。(4)CsA联合供体骨髓细胞可成功诱导大鼠同种异体肾移植免疫耐受。CsA联合供体骨髓细胞组与单纯CsA组比较生存时间明显延长;血清Th1细胞因子(IL-2、IFN-γ)及其在移植肾中的mRNA表达下降、血清Th2细胞因子(IL-4、IL-10)及其在移植肾中的mRNA表达升高,即Th1细胞因子向Th2细胞因子偏移;外周血CD4+CD25+ TR细胞比例升高;MLR实验结果表明CsA联合DBMC组与单纯CsA组比较,受体仅对供体特异性免疫反应降低,而对第三品系仍存在高免疫反应性;移植肾病理提示CsA联合DBMC组与单纯CsA组比较,排斥反应降低。 结论:(1)通过改良方法建立的大鼠同种异体肾移植模型是一种成功率较高、手术方法容易掌握的动物模型。(2)动态监测Th1/Th2细胞因子在外周血清中的浓度或其mRNA在移植肾组织中的表达水平可预测和判断急性排斥反应的发生,Th1细胞因子水平升高提示受体与移植肾之间存在高免疫反应状态,有发生急性排斥反应的可能;Th2细胞因子水平升高提示受体与移植肾之间存在低免疫反应或耐受状态。(3)CD4+CD25+ TR细胞在抑制肾脏移植排斥反应中发挥重要作用,动态监测外周血中CD4+CD25+ TR细胞的水平可预测和判断急性排斥反应的发生,了解肾脏移植后受体和移植肾之间的免疫反应程度或耐受状态。(4)CsA联合供体骨髓细胞可成功诱导大鼠同种异体肾移植免疫耐受。其机理与Th1细胞因子向Th2细胞因子偏移、受体内CD4+CD25+ TR细胞比例升高有关。


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