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IL-31在皮肤炎症中的作用及作用机制研究

黄俊琼  
【摘要】: 目的:克隆人IL-31基因、构建原核及真核表达载体,在大肠杆菌及哺乳动物细胞中表达,纯化IL-31蛋白,研究其在皮肤炎症中的作用及作用机制。 方法:PMA、PHA刺激正常人外周血单个核细胞,提取细胞总RNA,采用RT-PCR克隆人IL-31基因,将其克隆到原核表达载体pET28a(+),通过IPTG诱导目的基因在大肠杆菌中表达;同时将其克隆到真核表达载体pcDNA3.1/myc-His(-)A,将重组质粒转染CHO细胞,用RT-PCR和western-blot分析rhIL-31在CHO细胞中的表达。Ni树脂纯化在原核及真核细胞表达的his融合蛋白;用不同剂量rhIL-31刺激人表皮角质细胞HaCaT,利用transwell穿孔板检测HaCaT细胞培养上清对外周血单个核细胞的趋化作用,RT-PCR、荧光定量PCR检测巨噬细胞炎性蛋白-3β(MIP-3β)、胸腺和活化调节趋化因子(TARC)、巨噬细胞来源的趋化因子(MDC)及T细胞活化蛋白-3(TCA-3/I-309)的表达,western-blot检测STAT1、STAT3、STAT5磷酸化;小鼠皮内注射该目的蛋白,观察局部炎症表现,皮肤标本HE染色观察皮肤炎性特征,小鼠外周血白细胞计数及分类,ELISA法检测血清细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α水平,流式细胞仪分析胸腺及脾脏T淋巴细胞亚群。 结果:成功获得495bp的全长人IL-31基因,测序正确,经双酶切、PCR和序列测定鉴定,原核表达质粒构建正确,IPTG诱导目的基因在大肠杆菌中大量表达;真核表达质粒构建正确,可在CHO细胞中表达。该目的蛋白可刺激人表皮角质细胞HaCaT表达趋化因子MIP-3β、TARC、MDC及I-309,HaCaT细胞培养上清对人外周血单个核细胞有趋化作用,在rhIL-31刺激后,HaCaT细胞STAT1、STAT3、STAT5磷酸化增加;小鼠皮肤注射部位有脱毛,皮肤标本HE染色可见炎性细胞浸润,小鼠外周血白细胞总数增加,中性粒细胞比例增高,血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平增高,脾脏CD4~+T细胞占T细胞总数的百分比增高,CD8~+T细胞亚群占T细胞总数的百分比减少。 结论:成功克隆hIL-31基因,并构建了hIL-31原核及真核表达载体;应用Ni树脂对原核及真核表达的蛋白进行纯化,获得了高纯度的IL-31蛋白;皮内注射IL-31可诱导BALB/c小鼠皮肤炎症,局部炎性细胞浸润,血清炎性细胞因子表达水平增高,脾脏CD4~+T细胞比例增高;IL-31可诱导表皮角质细胞表达趋化因子MIP-3β、MDC、TARC和I-309,细胞培养上清对外周血淋巴细胞有趋化作用;IL-31可通过STAT途径转导信号。


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