野桑蚕和家蚕对拟除虫菊酯抗性的研究

【摘要】： 野桑蚕(Bombyx mandarina)和家蚕(Bombyx mori)为鳞翅目昆虫。对野桑蚕和家蚕进行拟除虫菊酯抗性的比较研究,将为鳞翅目害虫的防治和家蚕抗性育种提供重要的理论依据。拟除虫菊酯的作用靶标是神经轴突上的钠离子通道蛋白(sodium channel protein),而细胞色素P450第九家族的多个基因与昆虫对拟除虫菊酯抗性有关。本文测定了溴氰菊酯对野桑蚕和家蚕的毒力,进行了抗溴氰菊酯野桑蚕的筛选,克隆了野桑蚕和家蚕的钠离子通道蛋白基因,分析了氯氰菊酯对野桑蚕和家蚕CYP9家族基因的诱导转录,获得的主要结果如下: 1野桑蚕拟除虫菊酯抗药性和钠离子通道蛋白基因的克隆 1.1溴氰菊酯对野桑蚕和家蚕的毒力比较 采用点滴法测定了溴氰菊酯对野桑蚕和家蚕的毒力。吴江野桑蚕(YWJ)、启东野桑蚕(YQD)和苏大野桑蚕(YSD)分别是家蚕品种大造(Dazao)的15.89倍、11.67倍、10.11倍,家蚕品种L11是大造的4.37倍。 1.2野桑蚕对溴氰菊酯抗性品系的筛选 在桑叶育条件下,苏大野桑蚕经连续3代溴氰菊酯筛选,S4代抗药性倍数为16.48倍,S4代LD50 (0.445 ng/头)值较S0代LD50 (0.237 ng/头)提高了0.9倍。在人工饲料饲育条件下,吴江野桑蚕经6代人工饲料育和3代溴氰菊酯筛选,S6代抗药性倍数为18.67倍,S6代LD50 (0.504 ng/头)值较S0代LD50 (0.418 ng/头)值提高了0.2倍。 1.3野桑蚕和家蚕para型钠离子通道蛋白基因结构域Ⅱ的克隆与突变 根据家蚕钠离子通道蛋白基因部分序列(GenBank登录号:EF521818),设计特异引物,通过RT-PCR方法,克隆了编码吴江野桑蚕(YWJ)和家蚕品种大造的钠离子通道蛋白结构域II的cDNA片段。两片段长均为1 135bp ,编码378个氨基酸,没有发现与击倒抗性(knock down resistance,kdr)相关的点突变,但发现2个点突变I164L和V196A,推测可能这两个突变与野桑蚕对溴氰菊酯的抗性有关。 1.4野桑蚕和家蚕para型钠离子通道蛋白基因的克隆与选择性剪切 根据家蚕钠离子通道蛋白基因部分序列(GenBank登录号:BK005824,EF521818),设计引物,分段RT-PCR,克隆了家蚕大造钠离子通道蛋白基因Bmpara(GenBank登录号:EU688970)和吴江野桑蚕钠离子通道蛋白基因Bmmpara。根据克隆的野桑蚕钠离子通道蛋白基因序列和家蚕基因组序列,设计引物,采用PCR方法,克隆到3段野桑蚕基因组序列。序列分析表明,Bmpara的cDNA长为5 555 bp,编码1 851个氨基酸;Bmmpara的cDNA有6种,长度分别为5 555 bp、5 594 bp、5 432 bp、5 522 bp、5 561bp、5 399bp,分别编码1 851、1 864、1 810、1 840、1 853、1 799个氨基酸;3段野桑蚕基因组序列长度分别为1 632 bp、536 bp、3 220 bp。将Bmpara和Bmmpara的cDNA与家蚕基因组Blast分析和野桑蚕基因组片段比对,结果表明,Bmpara有34个外显子和33个内含子,Bmmpara除了与Bmpara有相同结果外,还发现Bmmpara有a(11个氨基酸ENDLGRTKKKK)、b(13个氨基酸GLKAALCGRCVSS)、c(41个氨基酸SLINFVAALCGAGGIQAFKTMRTLRALRPL RAMSRMQGMRV)3个选择性微外元,可能存在6种选择性剪接,构成野桑蚕钠离子通道蛋白不同亚型。 2野桑蚕和家蚕细胞色素P450的诱导与抗药性研究 2.1野桑蚕细胞色素P450氧化酶活性测定及CYP9家族基因的诱导转录 采用酶标板酶活性动力学法检测了氯氰菊酯诱导苏大野桑蚕中肠和脂肪体的PNOD活性,结果表明:氯氰菊酯诱导24 h,脂肪体、中肠PNOD活性分别增加了18.7%、12.2%。根据家蚕CYP9家族基因序列,设计引物,克隆了野桑蚕CYP9A21基因(GenBank登录号:FJ265741)、CYP9A22基因(GenBank登号:EF535806)和CYP9G3基因片断。用半定量RT-PCR方法分析了氯氰菊酯诱导野桑蚕CYP9家族基因的表达水平,结果表明,氯氰菊酯诱导24 h,CYP9A21基因在中肠的mRNA表达量是对照的2.1倍,CYP9A20、CYP9A21、CYP9G3基因在脂肪体的mRNA表达量是对照的1.9、3.5、1.4倍。推测野桑蚕CYP9A21等基因的的过量表达可能导致野桑蚕对氯氰菊酯氧化解毒代谢的增强。 2.2家蚕CYP9家族基因的诱导转录及CYP9A22的克隆与序列分析 用半定量RT-PCR方法分析氯氰菊酯诱导家蚕CYP9家族基因的表达水平,结果表明,氯氰菊酯诱导家蚕24 h, CYP9A20基因的中肠、CYP9A22基因的脂肪体、CYP9G3的脂肪体的mRNA表达量分别是对照的1.3、3.1、1.2倍。与野桑蚕相比,家蚕CYP9家族基因被诱导的mRNA表达量低,推测这可能是家蚕比野桑蚕对拟除虫菊酯更敏感的原因之一。采用RACE策略,克隆了CYP9A22基因(GenBank登录号:EF535804)。该基因cDNA全长1 707 bp,编码区长1 596 bp,编码531个氨基酸,推定的蛋白质分子质量为61 kD,等电点为7.71,与已知的CYP9家族的CYP9A14基因(棉铃虫Helicoverpa armigera)的氨基酸同源性达到62.3%。利用NNPP分析软件预测出转录起始位点,与根据CYP9A22全长cDNA序列推测的结果是一致的。TFSEARCH 1.3软件分析转录因子结合位点的结果显示,转录起始位点上游序列不仅包含启动子的核心结构序列TATA-box和CAAT-box,亦包含多个转录因子结合位点,如GATA-1,CdxA,Dfd等。