家蚕和野桑蚕粗肌丝结构基因的研究

【摘要】： 昆虫纲在生物多样性中有着重要地位,它在进化中的成功与飞行能力的获得有着密切的关系。而有着水解ATP并将化学能转换为动能的重要功能的粗肌丝是飞行的基础。昆虫的粗肌丝主要由肌球蛋白/肌球杆蛋白、副肌球蛋白/小副肌球蛋白、Myofilin和Flightin等蛋白组成。 肌球蛋白是由一对重链和两对轻链组成的六聚体蛋白,有着将化学能转变成机械能和形成粗肌丝的双重作用。肌球蛋白重链在大多数昆虫中由单基因编码,通过选择性编辑产生所有亚型的肽链。肌球杆蛋白和肌球蛋白重链有同一基因编码,它仅包括肌球蛋白重链的杆状区域和一个与轻链1同源的较小的N-末端。副肌球蛋白和小副肌球蛋白由同一基因编码,通过选择性启动子的使用产生的2个有着相同C-末端的蛋白。副肌球蛋白同源二聚体在肌肉的组装过程中,有着形成肌原纤维核心的作用,小副肌球蛋白的作用尚不明确。Flightin是仅在间接飞行肌中存在的一个小分子量的粗肌丝结构蛋白,可以调节间接飞行肌的性能。Myofilin是最近确认的一个粗肌丝结构蛋白,它可能位于肌原纤维的表面,功能尚不明确。 随着家蚕基因组测序的完成,必将极大地促进家蚕分子生物学的研究,确立家蚕在鳞翅目昆虫研究中的地位。而粗肌丝结构的研究,无论是对于探讨昆虫飞行机制的理论基础,还是在害虫扩散、迁移的预测,或资源昆虫的养殖驯化中,都有着重要的意义。但家蚕飞行能力的丧失,使它不能有效代表野外昆虫,因此我们以家蚕和与家蚕有着共同祖先的野桑蚕为材料,研究其粗肌丝结构基因。 在本试验中,我们通过RT-PCR、PCR、RACE和基因步移技术,对家蚕和野桑蚕的粗肌丝结构基因进行了研究,克隆到家蚕和野桑蚕肌球蛋白重链长度分别为2 2710 bp和2 3055 bp的基因组序列,包含转录起始位点上游约1.8 kb和poly(A)信号下游约1.0 kb。并通过生物信息学方法,确定了相关基因的结构。结果显示家蚕和野桑蚕肌球蛋白重链由单一基因编码,该基因在家蚕和野桑蚕中分别存在37和38个外显子,家蚕中的外显子24在野桑蚕中被1个大小约为300 bp的内含子分割。翻译起始密码子位于外显子2,在末端和次末端外显子中各有一个终止密码子。其中外显子3、8、11、14、17和22是含有多个外显子的相互排斥型选择性外显子组,在mRNA中存在且仅存在这些选择性编辑外显子组中的1个;可能含有,也可能排除次末端外显子。通过选择性编辑,这一基因最多可以转录780个亚型。其中在外显子13和选择性外显子3a、8b中存在导致氨基酸序列变化的差异。 副肌球蛋白/小副肌球蛋白基因含有17个外显子,在使用最上游启动子时转录编码副肌球蛋白的mRNA,而在使用位于外显子10后面的外显子时转录编码小副肌球蛋白的mRNA,两者共用3’-末端的7个外显子。克隆到的家蚕和野桑蚕副肌球蛋白mRNA长度分别为3 250 bp和3 321 bp,可以编码877个氨基酸残基,其中第106和135位氨基酸不同。 家蚕Myofilin基因含有9个外显子,可以产生3’-末端不同的5个亚型。所有这5个亚型的都使用5’-末端的3个外显子,且翻译起始密码子位于外显子2中。本实验从家蚕和野桑蚕成虫中分别获得3个亚型,分别编码113、193和345个氨基酸残基,其中家蚕和野桑蚕在亚型A和B中的125位存在一个氨基酸残基得差异。在成虫中野桑蚕可以产生2个不同的5’-末端,而家蚕仅使用其中的1个转录起始位点。家蚕的Flightin基因与黑腹果蝇基本相似,都是由4个外显子组成,且翻译起始密码子位于外显子2中。我们克隆到的家蚕和野桑蚕cDNA长度分别为661 bp和663 bp,编码158个氨基酸残基,其中在53位存在一个氨基酸的差异。 通过对比分析家蚕和野桑蚕的粗肌丝结构基因,结果表明,家蚕和野桑蚕之间不含有在黑腹果蝇中鉴定的影响飞行能力的突变。这2种生物间粗肌丝结构基因存在的差异,是否与家蚕和野桑蚕的飞行能力有关,还有待进一步深入研究。另外,在实验过程中,应用家蚕的研究信息和技术方法可以在野桑蚕中得到理想的结果,因此推测野桑蚕可以作为联结家蚕和野外鳞翅目昆虫研究的纽带。