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家蚕和野桑蚕对有机磷农药抗性的研究

李兵  
【摘要】: 家蚕(Bombyx mori)和野桑蚕(Bombyx mandarina)具有共同的起源,家蚕的人工驯化历史已经有5 700多年,经过长期的人工选择,家蚕的产丝性能得到了大幅度的提高,但对环境的适应性出现了退化的趋势;野桑蚕长期栖息在野外的桑树上,经过自然选择和农药的压力选择,其对野外环境的抗性,特别是对农药的抗性表现增强的趋势。一方面,家蚕由于对农药的抗性弱,每年都造成大量的农药中毒现象,有的蚕区已经放弃秋蚕的饲养;另一方面,野桑蚕由于对农药的抗性在增强,严重危害桑叶的生产,成为制约蚕丝业健康发展的一对矛盾。为了比较研究家蚕和野桑蚕对有机磷农药抗性差异的分子基础,本文以家蚕品种大造和苏州系统的野桑蚕为研究材料,比较研究了家蚕和野桑蚕对辛硫磷农药的敏感性、乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase, AChE)的活性、两种类型乙酰胆碱酯酶基因(acetylcholinesterase gene, ace)的结构、ace在农药诱导下的表达特征及家蚕和野桑蚕的ace2的体外表达产物对毒扁豆碱的敏感性。 以家蚕和野桑蚕的各龄起蚕为实验材料,采用浸叶法,研究了1~5龄家蚕和野桑蚕对辛硫磷农药的抗性的差异。结果表明,小蚕期家蚕和野桑蚕对辛硫磷的敏感性差异相对较小,随着龄期的增大,家蚕和野桑蚕对辛硫磷农药的敏感性差异较大,野桑蚕4龄LC50为家蚕的4.43倍,5龄为家蚕的4.02倍。 为了研究家蚕和野桑蚕的AChE的活性及毒扁豆碱对其抑制中量(I_(50))差异,本文以家蚕和野桑蚕2龄起蚕及5龄第3 d的头、中肠、脂肪体和丝腺为实验材料,测定了AChE的酶活性和I_(50)。结果表明,野桑蚕2龄起蚕的酶活是家蚕的1.65倍;5龄第3 d野桑蚕和家蚕的头、中肠、脂肪体和丝腺的酶活之比分别为:1.90倍、2.23倍、2.76倍、2.78倍;毒扁豆碱对家蚕和野桑蚕AChE的I_(50)分别为5.02×10~(-7) M和5.23×10~(-7) M。 构建了野桑蚕脑组织的cDNA文库,经鉴定文库的滴度达3.5×10~5 pfu/mL,文库插入片段的平均大小为1.2 kb。从文库的测序结果中获得野桑蚕化学感受蛋白基因(CSP3)完整的开放阅读框(登录号:EU439267)并对其进行了序列分析。结果表明:该基因读码框由384个核苷酸组成,编码127个氨基酸,分子量为14.6 kD。通过对该基因编码的氨基酸和其它17种昆虫的CSP编码的氨基酸进行进化分析,发现该基因与家蚕的CSP3的同源性最高,达96.85%。该基因的发现对于研究家蚕和野桑蚕对化学农药的敏感性具有重要意义。 利用RT-PCR方法,克隆了家蚕乙酰胆碱酯酶基因(Bm-ace1、Bm-ace2)。序列分析表明:Bm-ace1的ORF包含碱基2 025 bp,编码683个氨基酸,推导其表达蛋白的分子量为76.955 kD,等电点(pI)为6.36;Bm-ace2的ORF包含碱基1 917 bp,编码638个氨基酸,推导其表达蛋白的分子量为71.675 kD,等电点(pI)为5.49;Bm-ace1和Bm-ace2均具有乙酰胆碱酯酶基因(ace)的特征性区域。进化分析表明:Bm-ace1(ABY50088)和来源于中国野桑蚕的Bmm-ace1(ABM66370)的同源性最高,达99.71%, Bm-ace2(ABY50089)和来源于中国家蚕的Bm-ace2(NP_001037366)的同源关系最近,为99.84%。依据家蚕基因组信息,将Bm-ace1和Bm-ace2分别定位于第15号和第9号染色体,为深入研究家蚕对有机磷农药的抗性机制打下基础。 为了进一步研究野桑蚕和家蚕对辛硫磷农药的抗性差异的分子基础,采用了RT-PCR、RACE(rapid-amplification of cDNA ends)方法,克隆了野桑蚕两种AChE基因的cDNA全长,命名为Bmm-ace1和Bmm-ace2,对其进行了序列分析。研究结果表明:Bmm-ace1和家蚕ace1(Bm-ace1)编码的氨基酸数均为681,同源性达99.71%,存在2个氨基酸的突变(G664S、S307P),野桑蚕ace2(Bmm-ace2)和家蚕ace2(Bm-ace2)编码的氨基酸数为634,同源性达99.37%,存在4个氨基酸的突变(M18I、N233S、I310V、G621S)。进化分析表明,ace2在物种之间相对保守。分析Bmm-ace1的cDNA 5′非翻译序列(5′UTR)区域,与家蚕ace1基因(Bm-ace1)的cDNA 5′UTR(242个碱基)相比,Bmm-ace1的5′UTR包含有231个碱基,存在2个位点的点突变和一段连续11个碱基的缺失。通过克隆和测序分析野桑蚕基因组中Bmm-ace1的5′UTR片段,表明野桑蚕和家蚕ace1基因的RNA剪切都遵循GT-AG规则,但在其cDNA 5′UTR的RNA剪接过程中存在差异,野桑蚕在其cDNA上游+33处存在比家蚕少剪接的序列TGATTTGAAGG,而在其基因组中5′UTR的TGATTTGAAGG序列下游-4位点缺失ACAGA序列。研究结果可为深入探讨ace1基因和抗药性的关系提供新的信息。 为了比较研究家蚕和野桑蚕ace1和ace2基因在幼虫各发育阶段、各组织及其在辛硫磷农药诱导后的表达特征。本实验采用了半定量RT-PCR方法,研究了ace1、ace2在野桑蚕和家蚕的1~5龄各发育阶段、5龄第3 d的血淋巴、脑组织、中肠、脂肪体和丝腺各组织的表达特点;并且研究了在不同浓度的辛硫磷添食后的表达特征,并研究了高于致死中量浓度的辛硫磷诱导后,ace1和ace2在各组织的表达特点。发育表达分析表明,从1龄到5龄家蚕Bm-ace1和Bm-ace2的表达量都表现先下降后上升的趋势,其中Bm-ace1的最低表达量在3龄、Bm-ace2的最低表达量在2龄,野桑蚕从1龄到5龄Bmm-ace1和Bmm-ace2的表达量都表现逐步下降的趋势,其中Bmm-ace1的下降趋势较Bmm-ace2明显,和家蚕呈现不同的表达特征。组织表达分析表明,ace1只在家蚕和野桑蚕的脑组织和脂肪体中表达,ace2在家蚕和野桑蚕的所研究的组织中都有表达,ace1和ace2在脑组织和脂肪体内过量表达;ace1在家蚕和野桑蚕的脑组织表达量一致,而ace2在野桑蚕的脑组织表达量为家蚕的4.17倍。辛硫磷添食后的表达表明,2龄家蚕和野桑蚕在小于致死中量浓度时,随着浓度的上升,ace1的表达量都在增加,ace2在家蚕体内有增加的趋势,但在野桑蚕体内维持较高的表达量,总体表达量在不断下降;在高于致死中量的辛硫磷诱导下,ace1和ace2的表达量都在减少,但Bmm-ace2的减少量较少。高于致死中量的辛硫磷诱导后的组织表达分析表明,在脂肪体的表达量都存在减少的趋势,Bmm-ace1、Bm-ace1、Bm-ace2分别减少了82.67%、81.11%、84.50%,Bmm-ace2的表达减少程度较低,只有30.56%。 为了比较研究Bm-ace2和Bmm-ace2基因的表达产物的生物活性及其对农药代谢的差异,分别将Bm-ace2和Bmm-ace2克隆至杆状病毒转移载体pFastBacHTB中获得pFast-Bm-ace2和pFast-Bmm-ace2,分别将其转化DH10Bac感受态细胞后,用PCR方法检测证实所分离的重组病毒DNA中含有目的片段的基因。用脂质体法转染家蚕BmN细胞,分别获得重组病毒。SDS-PAGE和Western Blot分析表明,Bm-ace2和Bmm-ace2均被正确表达。对表达产物进行纯化后,测定的活性分别为1 847.94 mOD/ (min.mg)和1 892.17 mOD/ (min.mg),毒扁豆碱对二者的抵制中量分别为:I_(50)为1.73×10~(-7)M和1.87×10~(-7)M。 研究结果表明,Bmm-ace2的过量表达和突变是导致家蚕和野桑蚕对辛硫磷农药抗性差异的主要原因。本研究结果为家蚕的抗性品种选育和开发针对鳞翅目害虫的高效杀虫剂奠定了理论基础。


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