家蚕细胞色素P450基因及其定量方法的研究

【摘要】： 细胞色素P450酶系又称作多功能氧化酶(MFO),是广泛存在于所有需氧生物中的一类代谢酶系,细胞色素P450基因起源于35亿年前的一个共同祖先,是最古老和最庞大的超基因家族之一,在生命的过程中,它对内源物质的代谢与转化或外源化合物的活化与降解等进行催化和调控。在昆虫基因组中大约有100个左右的P450s,它们的作用涉及生长、发育、取食等过程,其对异生物质的代谢特性导致了昆虫对杀虫剂的抗药性和对植物有毒物质的耐受性,它还参与了昆虫体内保幼激素、蜕皮激素和脂肪酸等内源化合物的合成与代谢。 家蚕(Bombyx mori)是鳞翅目昆虫的模式生物,本研究以家蚕为研究对象,对家蚕P450基因CYP305B1基因组序列进行了分析;通过对目前家蚕实时定量PCR研究中常用的内源参照基因进行分析,提出了新的定量PCR方法,并应用此方法,对家蚕和野蚕(Bombyx mandarina)部分P450基因进行了定量研究。本论文的主要研究结果如下: 1.家蚕P450基因CYP305B1的克隆及其结构分析 为了研究家蚕P450基因CYP305B1的结构,采用了反向PCR(inverse PCR)技术,克隆了家蚕CYP305B1基因的基因组DNA,经序列测定,拼接得到家蚕CYP305B1全基因序列,并与野桑蚕P450基因CYP305B1V1进行了比较分析。结果表明,CYP305B1和CYP305B1V1在5’UTR上游-400至-770之间370 bp的序列同源性只有40.4%;在第1内含子中,与家蚕相比,野桑蚕在翻译起始密码ATG上游-340之前多了330 bp的插入序列,而在-110至-340 bp间两者同源性也只有46.9%。这些结果为深入研究该基因的功能提供了信息。 2.实时定量PCR方法的比较研究 为了比较目前常用的内源参照基因actin-3、GAPDH、28s rRNA,在实验样品中加入IFP2基因的mRNA和DNA混合物,作为跟踪标定基因,测定了家蚕各组织中的actin-3、GAPDH、28s rRNA基因的转录水平。同时测定了后部丝腺中的FibH、FibL基因,中部丝腺Ser-1基因的转录水平,并对两种归一化方法进行了比较。 结果表明,actin-3、GAPDH、28s rRNA在家蚕各组织中的差异极大,A3基因在后部丝腺中转录水平最高(1,098),中肠最低(9.9);GAPDH基因的转录水平以脂肪体最高(10,475),中肠最低(6.57)。28S rRNA基因的转录水平以脂肪体最高(97,321),中肠最低(2,178)。 如用与actin-3、GAPDH、28s rRNA相比的相对表达结果,则后部丝腺中的FibH ,FibL基因,中部丝腺Ser-1基因的转录水平,相互之间差距较大。而应用加入IFP2基因的mRNA和DNA混合物作为跟踪标定基因测到的是实际转录水平,基因FibL和FibH在后部丝腺中的转录水平分别为106,453和192,029,Ser-1基因在中部丝腺中的转录水平为196,539。我们把同时加入mRNA和DNA混合物,作为跟踪标定基因的测定方法,称为双跟踪标定定量PCR,所得结果称为基因的表观转录活性。 3.杀虫剂诱导的P450基因的表观转录活性 应用双跟踪标定定量PCR方法,测定了野蚕和不同品种家蚕P450基因的表观转录活性。同时,测定了在杀虫剂敌敌畏和溴氰菊酯诱导下,家蚕L11和野蚕不同P450基因的表观转录活性。 结果表明,家蚕品种菁松中P450基因主要在中肠中有较高的转录,其次是脂肪体;家蚕品种皓月P450基因在丝腺中有较高转录;野桑蚕的P450基因的表观转录水平,以丝腺最高,其次是中肠。 在敌敌畏和溴氰菊酯诱导下,L11中肠的P450基因的转录水平上调最显著,其次是脂肪体。L11的P450基因以CYP9A19、CYP9A22显著上调。野桑蚕在溴氰菊酯诱导下,CYP9A19、CYP9A22均有显著上调,且达到较高转录活性,而在敌敌畏诱导下野桑蚕被测P450基因未检测到较高的转录水平。 4.氟化物诱导下家蚕P450基因的表观转录水平 应用双跟踪标定定量PCR方法,测定了家蚕在NaF诱导下的P450基因的表观转录活性。结果表明,CYP9A19,CYP9A22在中肠中具有较高表观转录活性,而CYP305B1,CYP4M5则在脂肪体中有较高表观转录活性。 实验表明,NaF诱导下的时间曲线有组织特异性,我们把中肠、脂肪体的诱导称为正向诱导,这反映了家蚕对NaF的抵抗作用,把马氏管中的诱导称为反向诱导,这反映了NaF对家蚕的毒害作用。并由此提出了在今后家蚕抗性研究中应综合考虑这两方面因素的新观点。