收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

表达dsRNA的转基因家蚕对BmNPV的抗性研究

薛仁宇  
【摘要】: 家蚕血液型脓病是由家蚕核型多角体病毒引起的一种传染性病毒病,是养蚕业中危害最大的病害,至今尚无有効的防治药物,一旦发生往往会造成巨大的损失。利用RNAi对病毒基因的干扰作用,通过转基因的方法赋予家蚕对BmNPV的抗性,是突破传统育种方法,定向改造家蚕性状的一种新途径。要实现这一目标,必需有二个基础,一是外源基因高效导入及筛选的家蚕转基因系统,二是合适的能通过RNAi有效抑制病毒复制的靶基因。已有的研究表明利用RNAi技术通过干扰ie-1、lef-1和gp64基因均可以有效抑制BmNPV的增殖,其中以ie-1作为RNAi的靶基因抑制BmNPV复制的效率最高,以gp64作为靶基因抑制BmNPV复制的效率最差。由于选择干扰的靶基因不同,抑制病毒复制的效率相差甚远,即使对于同一基因,针对不同区域的siRNA其效率也有很大差异;尽管荧光蛋白报告基因方便了转基因蚕筛选,但至今似乎仍没有一个快速有效的理想方法。 为了能通过RNAi和转基因有机结合,提高家蚕对BmNPV的抗性,本研究首先在体外,比较了不同siRNA在家蚕培养细胞中抑制病毒复制的效率,针对ie-1、lef-1基因不同区域,研究siRNA抑制BmNPV复制效果,结果显示ie-siRNA对BmNPV抑制的效率要显著高于lef-siRNA,其中以ie-1-97-siRNA(5′-GCCCAACGACUAUUUGAAUdTdT-3′)效果最好;其次开展了家蚕转基因体系的优化研究,结果显示外源基因导入家蚕卵中的效率以先交后注的精子介导法为高,用G418对转基因蚕筛选的合适浓度和时机应选择在1眠前一天添食15 mg/mL的G418一天,接着在2龄起蚕再用20 mg/mL的G418筛选一天,从3龄开始可以通过蚕的大小实现对转基因蚕的初步筛选;第三将包含ie-97-siRNA对应区域的ie-1 dsRNA表达元件以及neo表达元件一起克隆进piggyBac转座子载体形成pigA3-IE-Neo的转基因载体;第四将该载体转染细胞后获得的稳定转化细胞对10~(-5)滴度的BmNPV有一定的抗性,通过精子介导法将转基因载体导入家蚕卵、利用G418和绿色荧光双重筛选获得了转基因家蚕,并通过PCR和点杂交对转基因家蚕进行了鉴定。最后通过人工感染BmNPV对G2、G3代转基因家蚕的抗性进行了鉴定,结果显示不同系统的转基因家蚕对病毒的抗性存在显著差异,转基因蚕比正常蚕的平均死亡率均低10%左右,有些系统可以达到20%-60%,而在被感染的转基因蚕中ie-1 mRNA、lef-1 mRNA相对水平较被感染的正常蚕分别低230和850倍左右。 本研究促进了抗BmNPV的家蚕新素材创造,获得的转基因家蚕具有潜在的应用价值。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 卓兵,王茜龄,朱勇;催青温度对家蚕抗核型多角体病毒(BmNPV)影响的研究[J];蚕学通讯;2004年02期
2 李兵,沈卫德;从野桑蚕体内分离的NPV与BmNPV、AcMNPV间的RAPD分析[J];江苏农业科学;2003年06期
3 曹阳,徐兴耀,黄自然,钟仰进,谭佩婵;由家蚕蛹─BmNPV系统建立环境诱变剂检测分析模型的初步研究[J];蚕业科学;1997年04期
4 顾奇伟,林建国,王芳,张传溪;BmNPV几丁质酶基因的表达及其产物对Bt杀虫剂的增效作用[J];农业生物技术学报;2005年01期
5 沈卫德,李兵,季平,刘丽华;从野桑蚕分离的NPV与BmNPV、ApNPV间的RAPD分析[J];蚕业科学;2003年02期
6 张建军,周成刚,王勇;BmNPV对几种鳞翅目农林害虫的感染性研究初报[J];山东林业科技;2004年03期
7 杨瑞丽,金勇丰,吴玉澄,张耀洲,吴祥甫;利用家蚕生物反应器生产有用蛋白的研究[J];浙江大学学报(农业与生命科学版);2001年02期
8 魏克强,许梓荣;利用家蚕生物反应器生产基因工程疫苗的研究[J];中国兽药杂志;2004年05期
9 吴福泉,蔡月仙,廖森泰,应霞玲,王森才;BmNPV对鳞翅目害虫的侵染试验初报[J];广东农业科学;1999年04期
10 李兵,季平,卫正国,陈玉华,沈卫德;野蚕体内分离的NPV和BmNPV对家蚕和野蚕的交叉感染性研究[J];中国蚕业;2003年04期
11 孙京臣;金丰良;徐兴耀;谭佩婵;;不同地区BmNPV对家蚕致死中量的比较研究[J];广东蚕业;2001年04期
12 贡成良,卢铿明;家蚕核型多角体病毒四角形多角体的研究[J];蚕业科学;1993年01期
13 兰天云;陈金娥;张金卫;杨惠娟;李建营;丁农;钟伯雄;段家龙;;BmNPV抗性差异蚕品种感染病毒后的中肠蛋白质组变化分析[J];蚕桑通报;2009年01期
14 吴福泉;杨琼;肖阳;陈列辉;刘新涛;邢东旭;罗国庆;唐翠明;王振江;;累代添食BmNPV的选拔效果初报[J];广东蚕业;2010年04期
15 赵天福;日本留学见闻[J];蚕学通讯;1998年02期
16 徐颖,朱成钢,金勇丰,张耀洲;dsRNA对家蚕核多角体病毒(BmNPV)复制的抑制作用[J];科学通报;2004年11期
17 李俊;屈达才;邱靖芸;;家蚕核型多角体病毒多角体的快速提取方法[J];广西蚕业;2011年01期
18 张欣;冯颖;丁伟峰;马涛;;离体昆虫细胞对AcNPV和BmNPV的敏感性测定与分析[J];林业科学研究;2011年03期
19 蒋正枝,孙丽珍;家蚕杆状病毒(BmNPV)生物反应器规模化生产技术[J];中国蚕业;2002年04期
20 孙京臣;金丰良;徐兴耀;谭佩婵;;不同地区BmNPV药物耐受性的测定[J];广东蚕业;2002年01期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 李文学;青学刚;刘俊凤;刘刚;肖金树;徐安英;;家蚕品种871C×872C对BmNPV抗性鉴定研究[A];全国家蚕病害控制技术与安全养蚕模式学术研讨会论文集[C];2010年
2 崔颖俊;吴立娜;赵巧玲;裘智勇;沈兴家;唐顺明;郭锡杰;;家蚕幼虫感染BmNPV后血淋巴蛋白质组学分析[A];中国蚕学会第六届青年学术研讨会论文集(2)[C];2009年
3 潘敏慧;吕军;鲁成;;BmNPV的双基因干涉对病毒增殖的影响[A];中国蚕学会第八届暨国家蚕桑产业技术体系家(柞)蚕遗传育种及良种繁育学术研讨会论文集[C];2011年
4 贡成良;;转基因RNAi提高家蚕对BmNPV抗性研究[A];全国家蚕病害控制技术与安全养蚕模式学术研讨会论文集[C];2010年
5 张鹏杰;薛仁宇;曹广力;贡成良;;双元表达短dsRNAs的转化细胞/家蚕对BmNPV的抗性研究[A];全国家蚕病害控制技术与安全养蚕模式学术研讨会论文集[C];2010年
6 叶秋霞;鲁银松;薛仁宇;曹广力;贡成良;;表达短Lef-1 dsRNA的转基因家蚕抑制BmNPV增殖研究[A];全国家蚕病害控制技术与安全养蚕模式学术研讨会论文集[C];2010年
7 张晓丽;彭景琨;马焕艳;潘中华;郑小坚;曹广力;薛仁宇;贡成良;;家蚕JAK/STAT信号通路相关基因及对BmNPV感染应答初探[A];中国蚕学会商品性小蚕饲养规程和蚕病防控学术研讨会论文集[C];2010年
8 朱莎;王文兵;李兵;沈卫德;;家蚕核型多角体病毒(BmNPV)基因gp41及Da26的融合表达[A];中国蚕学会第六届青年学术研讨会论文集(2)[C];2009年
9 吴福泉;杨琼;肖阳;陈列辉;刘新涛;邢东旭;罗国庆;唐翠明;王振江;;累代添食BmNPV的选拔效果初报[A];华东·华中地区第十二次蚕种学术研讨会论文集[C];2010年
10 李兵;沈卫德;;从野桑蚕体内分离的NPV和BmNPV、AcMNPV间的RAPD分析[A];中国蚕学会第七次全国代表大会论文集[C];2003年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 蒋亮;基于转基因工程的家蚕核型多角体病毒(BmNPV)抗性素材创新及抗性机制研究[D];西南大学;2013年
2 周阳;家蚕核型多角体病毒(BmNPV)Bm5的基因分析及利用基因芯片筛选抗BmNPV相关基因[D];江苏大学;2010年
3 梁湘;家蚕核型多角体病毒分子流行病学调查及宿主特异性研究[D];广西大学;2012年
4 薛仁宇;表达dsRNA的转基因家蚕对BmNPV的抗性研究[D];苏州大学;2009年
5 相兴伟;家蚕BmNPV ODV-E56/BmP95的生物学功能及多角体包埋外源蛋白的研究[D];浙江大学;2013年
6 曹翠平;家蚕新型高效杆状病毒表达系统的开发和应用研究[D];浙江大学;2007年
7 Bhaskar Roy(若伊);几种动物抗原在家蚕体内表达及shRNA体内外表达提高家蚕对核型多角体病毒抗性的研究[D];浙江大学;2012年
8 李兴华;纤维素酶产生菌的筛选及纤维素酶基因在家蚕中的表达研究[D];浙江大学;2011年
9 朱立成;纳豆激酶和hGM-CSF在家蚕杆状病毒表达系统中表达纯化及活性研究[D];浙江大学;2005年
10 田彩红;家蚕核型多角体病毒Bm41和Bm51基因分析[D];浙江大学;2009年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 王婷婷;两株对BmNPV侵染差异的家蚕细胞系的全基因组表达谱分析[D];西南大学;2012年
2 陈和;报告基因稳定转化BmN细胞测定BmNPV滴度方法的建立[D];浙江理工大学;2012年
3 何倩;家蚕核型多角体病毒(BmNPV)增殖复制关键基因的筛选与鉴定[D];西南大学;2014年
4 匡秀秀;家蚕核型多角体病毒BmNPV39k启动子的分析与改造[D];西南大学;2013年
5 袁佳;家蚕核型多角体病毒(BmNPV)lef-12基因的功能分析[D];浙江理工大学;2014年
6 费伟强;复制缺陷型BmNPV载体的构建及初步应用研究[D];浙江理工大学;2013年
7 李娜;抗BmNPV诱导型启动子转基因干涉载体的构建[D];西南大学;2010年
8 陈艳萍;BmNPV病毒感染后家蚕中肠围食膜蛋白质的变化[D];西南大学;2014年
9 冯娟;建立恢复重组BmNPV包涵体的拯救细胞系[D];河南农业大学;2010年
10 田甜;转基因干涉BmNPV病毒的gp64与lef-1基因片段对病毒体外增殖的影响[D];西南大学;2010年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978