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Dynein在α-synuclein自噬性清除中的作用

蔡增林  
【摘要】: 第一部分MPP+通过干扰动力蛋白活性阻碍α-synuclein的自噬性降解 目的本研究的目的是探讨是否MPP+通过干扰动力蛋白(dynein)活性导致α-突触核蛋白(α-synuclein)的自噬性清除障碍及其异常聚集。 方法取PC12细胞及我们成功构建的表达含人突变型A30Pα-synuclein的PC12细胞,按实验要求把细胞分为PC12细胞组、MPP+处理PC12细胞组、表达含人突变型A30Pα-synuclein的PC12细胞组和MPP+处理表达含人突变型A30Pα-synuclein的PC12细胞组。在MPP+处理24h后,对细胞采用流式细胞术和MTT法检测细胞活力,半定量RT-PCR检测α-synuclein、LC3基因在mRNA水平表达的变化,Western Blot检测α-synuclein、LC3-Ⅱ、dynein在蛋白水平表达的变化,单丹磺酰戊二胺(monodansylcadaverin,MDC)染色观察自噬囊泡,免疫荧光双标观察自噬水平及α-synuclein、dynein、LC3和LAMP1在胞质内的共定位情况。 结果1)PC12细胞和表达含人突变型A30Pα-synuclein的PC12细胞经MPP+处理后细胞活力明显下降(与正常组比较分别为P0.001和P=0.002),同时,细胞凋亡率明显增加,尤以MPP+处理表达含人突变型A30Pα-synuclein的PC12细胞组最显著;2)半定量RT-PCR的结果显示:各组细胞α-synuclein和LC3 mRNA基因表达水平较MPP+处理前均明显上升;3)Western Blot显示:MPP+处理后PC12细胞和表达含人突变型A30Pα-synuclein的PC12细胞dynein的蛋白表达水平均较处理前明显下降(t=2.8414,P=0.0234;t=2.2671,P=0.043),而α-synuclein低聚体表达增加,LC3-Ⅱ水平升高(P均0.05);4)MDC染色显示:MPP+处理后,PC12细胞和表达含人突变型A30Pα-synuclein的PC12细胞的自噬泡数目明显增加;5)免疫荧光结果表明:MPP+处理后,LC3阳性的自噬体数目增加,并且在胞内可见较大的自噬体,与α-synuclein的共定位也增加;α-synuclein明显聚集,并散布于胞质内,而dynein失去负端运动趋势,聚集于胞质外周,并且与α-synuclein失去共定位,同时LAMP1标记的溶酶体也聚集于胞质外周,与LC3标记的自噬体及dynein失去共定位。 结论MPP+处理后,虽然自噬体的数目增加,但MPP+明显影响了dynein的负端运动趋势,使其聚集于胞质外周,阻碍了其运输功能,从而导致自噬体与溶酶体融合程度的下降,致使α-synuclein聚集体的自噬性清除障碍,因此,动力蛋白活性在PD的发病机制中起重要作用,是治疗帕金森病的一个重要潜在靶点。 第二部分动力蛋白活性在α-synuclein的自噬性降解中的作用 目的通过给予PC12细胞ATP和EHNA影响动力蛋白活性,以及动力蛋白过表达来研究其在α-突触核蛋白(α-synuclein)自噬性清除中的作用。 方法MTT法检测不同浓度EHNA、ATP处理对PC12细胞活力的影响;Western Blot检测正常PC12细胞、EHNA处理、MPP+处理、MPP+处理后再予ATP处理后细胞的LC3-Ⅱ、α-synuclein、dynein表达变化;激光共聚焦显微镜下观察PC12细胞在不同药物处理前后的α-synuclein、LC3和动力蛋白在细胞内的共定位;透射电镜观察各株PC12细胞处理24小时后的细胞超微结构改变。构建pDsRED2-N1-DYNEIN重组质粒并转染细胞。 结果1)PC12细胞加入EHNA或MPP+后,LC3-II水平均明显增加(Q值分别为18.7787和25.0773,P均0.01)及Dynein表达的下降(Q值分别为17.7923和17.8722,P均0.01),而加入ATP后可明显降低LC3-II水平、升高了dynein水平(与EHNA和MPP+处理组比较P均0.01)。另外EHNA、MPP+处理均导致α-synuclein表达的升高,加入ATP后可明显降低了α-synuclein的水平。2)激光共聚集显微镜显示结果和WesternBlot结果基本一致,MPP+、EHNA处理后均导致α-synuclein和LC3累积光密度的升高、dynein光密度的下降,加入ATP后可明显升高了dynein累积光密度从而降低了由MPP+引起的α-synuclein和LC3累积光密度的升高。3)电镜结果表明:与未经药物处理对照组相比,PC12细胞MPP+、EHNA处理后,细胞核膜皱折,核染色质散聚、边集,见双层膜的自噬囊泡形成,部分细胞有凋亡倾向;而ATP处理24h后PC12细胞,细胞膜、核膜完整,染色质结构正常,胞质中线粒体形态分布及数目正常,并可见自噬溶酶体形成,促进了自噬溶酶体的融合。4)动力蛋白过表达后α-synuclein蛋白水平下降。 结论MPP+和EHNA抑制了动力蛋白的活性,阻碍了其运输功能,从而导致自噬体与溶酶体融合程度的下降,导致了自噬应激,致使α-synuclein的自噬性清除障碍,而加入ATP后可逆转这一病理变化,通过提高动力蛋白的活性,增加了α-synuclein的自噬性清除,动力蛋白过表达有助于α-synuclein的清除。因此,动力蛋白的活性可能关系到细胞内聚集体有关的疾病(如PD),从提高动力蛋白活性的角度来治疗帕金森病是一个重要潜在靶点。


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