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SELDI-TOF-MS筛选差异蛋白在肺部良恶性疾病鉴别及临床决策中的研究

林强  
【摘要】: 背景:肺癌是人类最为常见的恶性肿瘤,近年来发病率逐年上升。尽管随着医疗手段的不断提高,肺癌患者早期诊断以及预后在不断改善,但是相对于其他肿瘤而言,肺癌的预后仍旧较差,总体5年生存率在美国约15%,在欧洲约10%,在发展中国家大约8.9%。肺癌容易发生转移和局部外侵,目前而言缺少有效的早期诊断方法,而患者的预后与肿瘤的分期密切相关,对于肿瘤局限的患者5年生存率在49.5%,对于局部外侵或者淋巴结转移的病例5年生存率为20.6%,对于远处转移的患者5年生存率仅为2.8%。因此,如何能够对肺癌做出准确的早期诊断已经成为影响肺癌治疗效果的重要因素。本研究利用SELDI-TOF-MS技术对肺部良恶性疾病的蛋白质表达进行分析,寻找肺癌特异性的蛋白质表达,以期为肺癌的早期诊断提供一定帮助。另外我们对不同临床病理特征的肺癌组别进行差异蛋白质表达的分析,以期寻找影响肺癌疾病进展和分期某些重要的蛋白质并且建立临床决策模型以希望为临床肺癌的诊治提供帮助。 第一部分蛋白质芯片SELDI-TOF-MS技术平台建立 目的:建立蛋白质芯片SELDI-TOF-MS技术平台,对其可靠性进行确认。 材料和方法:对同一血浆样品在6个不同芯片位点进行蛋白质指纹图谱检测,分析随机选取的蛋白质峰质荷比及峰强度的变异系数(CV)。 结果:同一血浆样品在6个不同芯片位点的质荷比(M/Z)CV值为4.88E-04( 1‰),同一血浆样品在6个不同芯片位点的质荷比(M/Z)强度的CV值为0.12(0.2)。 结论:SELDI-TOF-MS是重复性较好、较为可靠的蛋白质组学研究技术。 第二部分肺癌患者不同临床病理特征间蛋白质指纹图谱的比较 目的:通过测定肺癌患者血浆蛋白表达情况,筛选出与疾病诊断、分期和其它临床病理特征相关的差异蛋白。 材料和方法:应用表面增强激光解吸电离-飞行时间-质谱技术(SELDI-TOF-MS)测定108例肺腺癌、26例肺部良性疾病,分析与疾病的诊断、分期相关的差异蛋白表达。肺癌的分期为UICC/AJCC于2002年联合制定的第六版肺癌TMN国际分期。结果1.对肺癌患者和肺部良性疾病的血浆蛋白质指纹图谱进行分析,结果发现11个M/Z位点蛋白质表达存在显著差异(P0.05),其中1450.24、1471.95、6794.65、8289.41、8381.62、14374.77位点的蛋白质表达强度在肺癌血浆中显著增高;7617.22、11457.74、15590.85、15813.76及22938.34位点的蛋白质表达强度在肺癌血浆中显著降低。 2.对于Ⅰ期肺癌、肺部良性疾病的血浆蛋白质指纹图谱分析,结果发现43个M/Z位点蛋白质表达存在显著差异(P0.05),其中1411.4、1447.63、1471.95、1479.1、1496.96、1520.47、1548、1564.67、1641.54、2803.03、2841.1、4768.71、6802.1、7005.24、8181.59、8289.41、9573、9754.75、12054.43、14184.82、14374.77、16454.35、16678.98、22938.34、24283.03、24602.05、29125.61位点的蛋白质表达强度在肺癌血浆中显著增高;1217.46、2696.98、4874.59、6311.76、6520.82、7617.22、7983.73、8524.95、8788.99、9045.58、9176.61、11457.74、13483.64、15589.4、15813.76、27561.76位点的蛋白质表达强度在肺癌血浆中显著降低。 3.对108例肺癌患者的血浆蛋白质指纹图谱进行分析,结果发现在不同病理分期的患者血浆中有40个差异的蛋白质峰(P0.05)。其中随着病期增加1203.76、1223.51、2695.20、4873.45、5181.75、6315.51、6350.75、6516.06、7627.34、8386.03、8530.45、8776.55、9045.58、9165.15、11456.55、13481.16、14840.41、15604.89、15836.05、22961.58及27548.47位点的蛋白质强度有升高趋势;1411.40、1450.24、1471.95、1479.10、2803.03、2841.10、6441.20、6576.90、8289.41、8918.22、、9573.00、9772.02、14184.82、14374.77、16454.35、16678.98、24283.03、24602.05、29125.61位点的蛋白质强度有下降趋势。 4.对肺癌患者的血浆蛋白质指纹图谱进行分析,结果发现不同分化程度的肺癌患者血浆中存在28个差异蛋白峰(P0.05)。分别为:1203.76、1223.51、1411.4、1450.24、1471.95、1479.1、2695.2、2803.03、2841.1、4874.59、5181.75、6315.51、6509.97、6780.06、7627.34、8289.41、8776.55、9573、9772.02、11456.55、13495.44、14374.77、15604.89、15836.05、22961.58、24283.03、24602.05、29125.61。 5.1对108例肺癌患者不同淋巴结转移状态进行差异蛋白质的分析,结果发现40个血浆蛋白质峰差异(P0.05)。其中1203.76、1223.51、2695.2、4873.45、5181.75、6315.51、6350.75、6441.2、6516.06、6576.9、7627.34、8386.03、8530.45、8776.55、9165.15、11456.55、13481.16、14840.41、15604.89、15836.05、22961.58、27548.47位点的蛋白在淋巴结转移组中显著增加;1411.4、1450.24、1471.95、1479.1、2803.03、2841.1、6780.06、8289.41、8918.22、9573、9772.02、14184.82、14374.77、16454.35、16678.98、24283.03、24602.05、29125.61位点的蛋白在淋巴结转移组中显著降低。 5.2进一步在淋巴结转移的病例中分析肺内淋巴结转移和纵隔淋巴结转移的情况,结果发现8个位点的蛋白质表达存在差异(P0.05)。其中1203.76、1223.32、4515.97、9022.82、9175.79、9233.91位点的蛋白强度在纵隔淋巴结转移的病例中显著升高,11445.96、23551.51位点的蛋白强度在纵隔淋巴结转移的病例中显著下降。 5.3另外在淋巴结转移的肺癌患者中分析单个淋巴结转移和2个以上淋巴结转移患者血浆蛋白质表达差异,结果发现8409.17这个位点的血浆蛋白质表达差异(P0.05)。对转移淋巴结≤3个和3个的肺癌患者的血浆蛋白质表达进行分析,结果发现8409.17和8606.14位点的血浆蛋白质表达存在差异(P0.05) 6.对108例肺癌患者的不同T分期进行蛋白质指纹图谱的分析,结果发现32个差异蛋白质峰存在差异(P0.05)。其中1203.76、1223.51、2695.20、4874.59、5181.75、6315.51、6350.75、6509.97、7627.34、8386.03、8530.45、11456.55、13495.44、14840.41、22961.58、27548.47位点的蛋白质强度随着T分期的增加而增加;1411.40、1450.24、1471.95、1479.10、2803.03、2841.10、8918.22、9573.00、9772.02、14184.82、14374.77、16454.35、16678.98、24283.03、24602.05、29125.61位点的蛋白质强度随着T分期的增加而降低。 7.在肿块≤2cm和2cm的两组中有12个差异蛋白(P0.05),它们分别是1203.76、1450.24、1471.95、1479.10、2803.03、4874.59、5181.75、8289.41、16454.35、16678.98、22961.58、27548.47。在肿块≤3cm和3cm组中有9个差异蛋白表达(P0.05),它们分别是1411.40、1450.24、1471.95、2803.03、5181.75、6780.06、11456.55、15604.89、15836.05。在肿块≤5cm和5cm的两组中有11个差异蛋白质表达(P0.05),它们分别是1411.40、1450.24、1471.95、2803.03、5181.75、6576.90、6780.06、8918.22、14840.41、15604.89、15836.05。在肿块≤7cm和7cm两组中未发现任何有差异的血浆蛋白质表达(P0.05)。 8.对≤50岁和50岁的两组肺癌患者进行差异蛋白质的比较,结果未发现任何有差异的蛋白质表达;对≤60岁和60岁的两组肺癌患者进行分析,结果发现仅有24283.03这个位点的蛋白质表达存在差异(P0.05);对≤70岁和70岁的两组肺癌患者进行分析,结果发现存在6个差异蛋白表达,他们分别是2841.10、6576.90、6690.84、6887.11、8289.41、15604.89。 9.对不同性别的肺癌患者进行血浆差异蛋白质分析,结果未发现任何有差异的蛋白表达(P0.05)。 结论:肺癌、肺部良性疾病的血浆蛋白质谱有着显著差异。筛选出的差异蛋白可能在肿瘤的发生、发展过程中起着重要作用。肿瘤的大小、淋巴结转移、疾病分期、细胞分化、年龄均是影响血浆蛋白质谱的重要因素。性别不影响肺癌血浆蛋白质谱的表达。对淋巴结转移细化中发现是否发生纵隔淋巴结转移对肿瘤患者血浆蛋白质谱的影响较大,而淋巴结转移个数对于蛋白质谱的影响较小。不同年龄组别中,年龄70岁上下组对血浆蛋白质谱的影响最大。2、3、5cm不同组别肺癌血浆中均存在较多的差异蛋白表达。 第三部分肺癌临床模型的研究 目的:建立肺癌诊断分期相关的模型,为临床决策提供依据。 材料和方法:利用筛选出的差异蛋白建立早期肺癌诊断、肺癌淋巴结转移、肺癌早晚期鉴别的决策树模型,并且对所建立的决策树模型进行盲法验证。结果:一、肺部孤立性结节的诊断 1.软件自动选出M/Z为1217.45和2696.98的2个蛋白峰,由54例Ⅰ期肺癌和26例肺部良性疾病建立决策树判断模型来诊断早期肺癌,模型的敏感性为96.30%,特异性为100%。 2.选择35例临床上体检发现直径2cm的肺部小结节对上述模型进行盲法验证,该模型盲法验证准确性为82.9%(29/35),灵敏度为81.3%(13/16),特异性为84.2%(16/19),阳性预测值为81.3%(13/16),阴性预测值为84.2%(16/19)。 二、肺癌淋巴结转移的判断 1.软件自动选出M/Z为1479.10、6576.89、6780.05、8776.55的4个蛋白峰,由108例肺癌建立决策树模型来诊断肺癌淋巴结转移,模型的敏感性为97.83%,特异性为91.94%。 2.35例肺癌病例进行盲法验证,结果显示该模型盲法验证准确性为74.3%(26/35),灵敏度为72.2%(13/18),特异性为76.5%(13/17),阳性预测值为76.5%(13/17),阴性预测值为72.2%(13/18)。 三、早晚期肺癌病例的判断 1.软件自动选出M/Z为1224.05、1447.63、1479.10的3个蛋白质峰,由54例Ⅰ期和28例Ⅲ期肺癌建立决策树模型来判别Ⅰ期和Ⅲ期肺癌,该模型的敏感性为94.44%,特异性为100%。 2.32例Ⅰ期和Ⅲ期肺癌病例进行盲法验证,结果显示该模型盲法验证准确性为84.4%(27/32),灵敏度为80.0%(12/15),特异性为88.2%(15/17),阳性预测值为85.7%(12/14),阴性预测值为83.3%(15/18)。 结论:本研究建立的与肺癌早期诊断与临床分期相关的决策树模型具备较高的诊断效能,能为临床提供一定帮助。


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