纤维蛋白原异常的临床和基础研究

【摘要】： 纤维蛋白原分子是由Aα、Bβ和γ链通过29对二硫键连接而成的六聚体,分子量为340 kDa。纤维蛋白原3条肽链分别由簇集于4q28-4q31约50 kb内的3个独立基因FGA、FGB和FGG编码。纤维蛋白原分子有个基本功能:一是,作为血小板膜糖蛋白IIb/IIIa的受体,参与血小板的活化聚集;二是,在凝血酶作用下,从纤维蛋白原转化为纤维蛋白凝块。然而,目前对于纤维蛋白原的代谢尚有许多未解之处。通过对纤维蛋白原异常特别是遗传性纤维蛋白原缺陷的研究,有助于深入了解纤维蛋白原功能和代谢。纤维蛋白原异常通常分为高纤维蛋白原血症、低纤维蛋白原血症、无纤维蛋白原血症、异常纤维蛋白原血症和低异常纤维蛋白原血症5种类型。我们在工作中发现高纤维蛋白原血症、低纤维蛋白原血症和低异常纤维蛋白原血症患者各一例,我们对其病因和发病机制进行了初步研究。 一、高纤维蛋白原血症对凝血时间的影响 目的诊断一例Turner综合征合并有肝细胞肝癌患者;证实高纤维蛋白原血症致凝血时间延长。方法根据凝固法原理检测患者手术前后血浆活化部分凝血酶时间(APTT)、凝血酶原时间(PT )和凝血酶时间(TT);运用Clauss法、免疫比浊法和Western blot分析血浆中纤维蛋白原水平;PCR扩增编码纤维蛋白原三肽链基因(FGA、FGB和FGG)的所有外显子以及外显子和内含子交界区,并直接测序分析;免疫组化法分析癌组织中纤维蛋白原的表达;免疫法检测患者血浆皮质醇、白介素-6和可溶性组织因子(sTF)的浓度。结果癌组织中纤维蛋白原的表达高于对照;手术前患者血浆纤维蛋白原抗原和活性分别为15.1±0.3 g/l和14.4±0.8 g/l。手术前血浆中纤维蛋白原及其组分和代谢产物泳动速率与正常对照比较无差异,而灰度明显加深。基因测序未发现碱基改变。血浆IL-6、皮质醇水平和sTF明显高于对照。血浆中纤维蛋白原被吸附逐渐降至正常后,延长的APTT、PT和TT值逐渐恢复正常。肿瘤被切除后,血浆纤维蛋白原水平、延长的凝血时间和升高的炎症因子均降至正常。结论Turner综合征合并有巨块型肝癌诊断明确;巨块型肝癌和高血浆IL-6和皮质醇水平是高纤维蛋白原血症的原因;高纤维蛋白原导致APTT、PT和TT值明显延长;高纤维蛋白原延长PT和TT值的作用被高血浆组织因子水平削弱。 二、纤维蛋白原Aα链Arg16His突变致遗传性异常纤维蛋白原血症 目的对一例遗传性异常纤维蛋白原血症家系进行表型和基因型分析。方法采集家系3代6人外周血,血凝仪检测APTT、PT和TT。纤维蛋白原活性和抗原分别用Clauss法和免疫比浊法检测,western blot分析血浆纤维蛋白原及其片断分布。PCR扩增纤维蛋白原基因FGA、FGB和FGG所有外显子及其侧翼序列,PCR产物纯化后直接测序。结果先证者APTT、PT正常,TT明显延长;纤维蛋白原抗原正常,活性降低;先证者母亲和胞姐表型与之相似。基因分析显示先证者纤维蛋白原FGA基因2号外显子G1233→A杂合碱基改变(密码子CGT→CAT),导致Arg16His错义突变,该突变源于母系。结论纤维蛋白原Aα链Arg16His杂合错义突变是遗传性异常纤维蛋白原血症的分子基础。 三、纤维蛋白原Bβ链基因4个碱基插入突变导致遗传性低异常纤维蛋白原血症 目的对一例遗传性低异常纤维蛋白原血症家系的病因和发病机制进行初步研究。方法采集家系4代16人外周血,血凝仪检测APTT、PT、TT和纤维蛋白原活性(Clauss法);免疫比浊法和ELISA法检测纤维蛋白原抗原;Western blot分析纤维蛋白原抗体的特异性和血浆纤维蛋白原γ链的表达;PCR扩增纤维蛋白原基因并直接测序。结果先证者的凝血时间明显延长:APTT 76.5 sec (N 28-40 sec), PT 79.5 sec (N 11-14.5 sec), TT 79.1 sec (N 14-21 sec);纤维蛋白原活性无法检测,抗原量0.43 g/l (N 2.0-5.0 g/l);家系其他成员的APTT、PT和TT值均正常,先证者父亲、母亲、胞弟和儿子的血浆纤维蛋白原活性比正常对照略低。基因分析发现先证者FGB exon 2核苷酸2819~2820之间插入GTTT,该突变为纯合改变,导致纤维蛋白原分子Bβ链在40位氨基酸处发生移码并在50位氨基酸处提前终止,该突变在先证者父母亲、胞弟和儿子为杂合状态。纤维蛋白原抗体特异性鉴定结果显示羊抗人纤维蛋白原γ链C末端多克隆抗体仅与γ链反应。Western blot分析:在还原性条件下,纤维蛋白原γ链的表达量与正常一致;在非还原性条件下,在148 KDa处的条带灰度稍强于对照。结论FGB GTTT插入突变致纤维蛋白原Bβ链框移是遗传性异常纤维蛋白原血症的分子基础。