环孢素A-pH敏感性纳米粒的药代动力学研究

【摘要】： 目的本文制备环孢素A–pH敏感性纳米粒(cyclosporine A–loaded pH–sensitive nanoparticles,CyA–NP)及其冻干粉末(Freeze–dried CyA–NP,Fd–CyA–NP)二种剂型,建立高效液相色谱(HPLC)法和高效液相色谱–串联质谱(HPLC–MS/MS)法测定二种制剂的体内生物样品中CyA的药物浓度,旨在研究CyA–NP在体内的吸收、分布、代谢和排泄,为其进一步研究与开发提供科学依据。 方法(1) CyA–NP和Fd–CyA–NP的制备及质量评价:应用乳化–溶剂扩散技术制备CyA–NP,通过真空冷冻干燥法制备其冻干粉末制剂。透射电镜观察纳米粒的表面形态;动态激光散射法测定平均粒径与粒度分布;HPLC法测定两种纳米粒制剂的包封率和载药量。(2)小鼠血液及各组织中CyA含量HPLC测定方法的建立及CyA–NP的组织分布及靶向性研究:以市售新山地明微乳制剂(Neoral)为参比制剂,小鼠单剂量灌胃给予两种制剂,采用液–液萃取法处理生物样品,环孢素D(cyclosporine D,CyD)为内标,HPLC法测定血液和各组织中药物浓度,以药动学参数(AUC, AUQ, Cmax, Tmax)和靶向参数(Te, RTe, TI)为评价指标。(3)犬血液中CyA含量HPLC测定方法的建立及Fd–CyA–NP的药代动力学研究:以双周期交叉随机试验设计法,六只家犬单剂量口服给予Fd–CyA–NP和Neoral,HPLC法测定CyA血药浓度,采用3P97软件计算药动学参数。(4)大鼠粪便及尿液中CyA含量HPLC–MS/MS测定方法的建立及CyA–NP的体内代谢研究:SD大鼠灌胃给予CyA–NP后,于不同时间段收集尿样及粪样,液–液萃取处理,正离子检测模式下,选择离子m/z1225→m/z1112(CyA)和m/z1239→m/z1099(CyD)进行多重反应检测(MRM),HPLC–MS/MS法测定样品中CyA含量,并根据代谢产物的相对分子质量及质谱行为,鉴定并阐述其结构。(5)大鼠肝微粒体中CyA含量HPLC测定方法的建立及CyA–NP的体外酶促动力学研究:差速离心法制备大鼠肝微粒体,Lowry法测定肝微粒体蛋白浓度,考察孵育时间、酶浓度和底物浓度对药物代谢速率的影响,并根据Lineweave–Brurk双倒数曲线,计算酶促动力学参数。 结果(1) CyA–NP和Fd–CyA–NP的平均粒径分别为43.9±0.8 nm、52.7±4.6 nm。包封率均高达99%左右,载药量分别为(23.9±0.1)%、(22.9±0.2)%。纳米粒子均呈规则的圆球形。(2)小鼠血液及组织中CyA含量HPLC测定方法的回收率均大于72%,日内、日间精密度良好,该方法符合生物样品分析的要求。经3P97软件拟合,两种制剂在小鼠体内药代动力学均符合口服吸收二室模型,CyA–NP的相对生物利用度为162.5%,体内药物浓度分布趋势为肝脏心脏肾脏脾脏肺脏,与Neoral相比,有一定的肾脏和心脏趋向性,在肝脏中无蓄积。(3)犬血液中CyA含量HPLC测定方法的回收率均大于94%,日内、日间精密度均小于10%,该方法符合生物样品分析的要求。经3P97软件拟合,两种制剂的药代动力学过程均符合二室模型。与Neoral相比,Fd–CyA–NP的AUC显著增大(P0.05),CL(s)显著降低(P0.05),相对生物利用度为135.9%。(4)大鼠排泄物中CyA含量HPLC–MS/MS测定方法的回收率均大于80%,日内及日间精密度小于8%,准确度在±15%范围内。口服给药84 h后,在尿液及粪便中CyA累积排泄量分别为6.48±1.29μg、625.80±289.08μg,大鼠粪便中检测到甲基化、羟基化和二羟基化代谢产物共七种,而尿样中有六种。(5)大鼠肝微粒体中CyA含量HPLC测定方法的回收率大于87%,日内、日间精密度均小于10%,该方法符合生物样品分析的要求。肝内清除率(CLint)比较,原料药组要大于CyA–NP组(P0.05),而最大反应速率(Vmax)和米氏常数(Km)无明显差异(P0.05)。孵育90 min后,原料药组药物代谢率(1.049±0.028μg·mL–1)高于CyA–NP(0.874±0.023μg·mL–1) (P0.05)。 结论建立的生物样品中CyA含量HPLC和HPLC–MS/MS测定方法灵敏、简便、重现性好,适用于生物样品中CyA浓度检测及药代动力学研究。CyA–NP体内组织分布及代谢广泛,促进了药物口服吸收,显著提高了CyA的生物利用度。研究结果显示,这种新型pH敏感性纳米药物输送系统具有良好的开发应用前景。