日本血吸虫低感染度宿主血清核酸检测及来源和代谢规律的研究

【摘要】： 目前,血吸虫病仍是一种严重危害人类健康的主要寄生虫病,影响范围涉及亚非拉数十个国家和地区。近年来,随着我国长期大范围地实施以化疗为主的血吸虫病防治策略,主要血吸虫病流行区的感染率与感染度已显著降低,但感染者仍近百万,流行区域并没有明显缩小。在当前血吸虫病感染率和感染度均呈低度化的新形势下,现有的诊断方法均不够理想,特别是对于反复感染和治疗后的病例,虫卵粪检法和循环抗原检测法的敏感度太低;而抗体检测又缺乏特异性,不能区分现症病人和既往感染者。随着分子生物学技术的发展,血吸虫病的核酸检测已成为当前血吸虫病诊断研究的热点之一。本课题组前期工作表明普通PCR法和LAMP法在日本血吸虫中、高感染度家兔模型的实验研究中具有早期诊断价值和疗效考核价值。本研究在普通PCR法的基础上,建立了一种新的巢式PCR法,进一步探索核酸检测法对日本血吸虫低感染度家兔血清DNA的检测敏感性,并对感染宿主血清中日本血吸虫核酸的来源及代谢规律作了深入探讨,初步评价了核酸检测用于日本血吸虫病病人血清的检测效果。全文共分三个部分: 一、巢式PCR法的建立及对日本血吸虫低感染度宿主血清DNA的检测 在普通PCR法的基础上建立了一种敏感性和特异性更高的巢式PCR法,采用巢式PCR的外引物扩增产物构建的重组质粒作敏感性检测,巢式PCR法检测的敏感性为10.2个拷贝,比普通PCR法高10倍。且巢式PCR扩增产物的电泳条带为单一、明亮的特异性条带,较普通PCR法可更准确的判断检测结果。本实验建立了更符合现场病人实际状况的日本血吸虫低感染度家兔模型(EPG50;虫数5对),采用巢式PCR法从感染后3d～19w的外周血清中均能扩增到日本血吸虫特异性DNA片段,尤其是感染30条血吸虫尾蚴的家兔,体内仅存活3对成虫(EPG=14)的外周血清也可检测出特异性DNA片段。实验证明,巢式PCR法可用于日本血吸虫低感染度宿主血清DNA的检测,具有潜在应用前景。 二、巢式PCR法检测日本血吸虫感染家兔血清DNA用于疗效考核的评价 应用巢式PCR法对日本血吸虫中感染度(EPG=232)家兔经吡喹酮治疗后的宿主血清DNA的检测结果表明,治疗后第17w(感染后24w)宿主血清中的血吸虫DNA转为阴性,比前期普通PCR法检测的结果晚6w,提示其具有更高的敏感性;而抗体检测于感染后30w仍维持较高的滴度,表明核酸检测法具有潜在的疗效考核价值。 三、巢式PCR法对100例日本血吸虫病慢性期病人血清DNA的检测 100例粪检阳性的慢性期病人血清,采用巢式PCR法检测的阳性检出率为78%,其中高感染度的阳性检出率为100%(4/4),中感染度的阳性检出率为90%(9/10),低感染度的阳性检出率为75.6%(65/86),阳性检出率与感染度相关。 四、日本血吸虫感染宿主血清核酸来源及代谢规律的研究 本实验建立了单、双性尾蚴感染的家兔模型。采用巢式PCR法从单性尾蚴感染家兔感染后3d ~ 3w的血清中均可扩增到日本血吸虫特异性DNA片段,感染后4w转为阴性。由此推断日本血吸虫感染后3d~3w,血清中的日本血吸虫核酸主要来源于移行过程中死亡的童虫残体或虫体发育过程中更新脱落的含有细胞核的表皮组织。而双性尾蚴感染的家兔感染后3d~7w均可扩增到阳性条带,根据日本血吸虫的生活史,血吸虫雌虫感染宿主4w后发育成熟并开始大量产卵,因此,本实验结果表明,宿主感染血吸虫4w后血清中的血吸虫核酸主要来源于死亡崩解的虫卵。为进一步研究血吸虫核酸在宿主外周血中的代谢规律,实验组对上述单性尾蚴感染的家兔连续3w检测为阴性结果后(即感染后第7w)给与吡喹酮治疗,同时对双性感染家兔也进行治疗。采用巢式PCR法继续检测的结果表明,单性感染的家兔给药后2d即可在宿主血清中检测到日本血吸虫特异性DNA片段,该阳性结果持续3w后复转阴;而双性感染家兔给药后16w均可检测到阳性条带。上述结果显示了宿主血清中血吸虫核酸代谢的动态变化,即源自死亡成虫残体的核酸代谢物于治疗后第2d即可出现在宿主外周血清中,分解代谢3w后逐渐消失;而源自血吸虫虫卵的核酸代谢产物,由于虫卵分批、不同步死亡和崩解,不同虫卵释放的核酸在宿主外周血清中可共同维持12w(从产卵时开始计算)。同时,上述结果进一步证明了前期有关宿主血清中的日本血吸虫核酸来源的推断,即感染早期(3d~3w)宿主血清中的血吸虫核酸来源于童虫,童虫核酸代谢产物的分解代谢时间与成虫一致(均为3w),感染后期(4w~23w)宿主血清中的血吸虫核酸主要来源于虫卵。本研究结果对核酸检测法用于日本血吸虫病早期诊断及疗效考核提供了重要的实验依据和理论基础。