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肝细胞肝癌相关基因中miRNA结合靶点内多态的筛选及功能分析

何艳  
【摘要】: 目的: 筛选肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)相关基因中miRNA结合靶点内的基因多态并验证其与HCC发生的关联性进而探讨其中的具体分子机制。 方法: (1)利用生物信息学方法结合文献报道筛选HCC相关基因,并在HCC相关基因3′UTRs或5′UTRs中预测目前人类已知miRNA的结合靶点,然后在预测靶点内筛出候选多态。(2)基于第一步预测结果,采用病例对照研究方法,PCR扩增结合聚丙烯胺凝胶电泳技术对部分候选多态进行基因分型,Logistic统计分析基因位点与HCC的关联性。(3)对发现的阳性关联基因多态位点,利用生物信息学的方法预测该位点可能结合的miRNA;采用定点突变和分子克隆技术,构建不同基因型荧光素酶表达载体,与特定miRNA共转染人肝癌细胞系(HepG2和SMCC7721),采用双荧光素酶报告系统对荧光素酶表达量进行检测。(4)采用Real-time RT-PCR方法,分析阳性关联位点不同基因型的肝癌组织样本目的基因的表达水平。 结果: (1)利用生物信息学方法结合文献报道筛选出HCC相关基因105个,并在HCC相关基因3′UTRs或5′UTRs中已知miRNA结合靶点内筛出16个候选多态(含SNPs和插入缺失多态)。(2)我们从16个候选多态中选取了两个插入缺失多态进行病例对照研究,分别是位于IL1A-3′UTR的rs3783553(“TTCA”4bp插入缺失)和位于VEGF-5′UTR的rs35569394(“TCCCACTCTTCCCACAGG”18bp插入缺失)。基因分型结果显示,rs3783553和rs35569394均具有较好多态性,其在对照样本中最低等位基因频率分别为0.385和0.255。两位点在对照样本中的等位基因频率分布均符合Hardy-weinberg平衡。卡方检验显示rs3783553的基因型和等位基因频率在HCC组和对照组均存在显著性差异。用Logistic回归分析校正年龄、性别、吸烟、饮酒及HBV感染因素后发现,与4N Ins/4N Del和4N Del/4N Del相比,携带有4N Ins/4N Ins的个体HCC易感性明显降低(OR=0.30,95%CI:0.17-0.54),趋势检验P值0.001。考虑到HBV感染与HCC发生的密切关系,我们对HBV进行了分层分析,结果显示,分层后插入型等位基因的保护作用仍能体现,但在HBV阳性的患者中更为突出。该结果提示,rs3783553多态可能在HBV感染的免疫调节过程中发挥作用。而rs35569394经上述分析后发现与HCC易感性不存在显著性关联,趋势检验P值=0.87。(3)根据rs3783553病例对照研究结果,我们分别构建了rs3783553两种不同基因型荧光素酶载体,基于生物信息学预测结果,将Pre-mir-122或Pre-mir-378与重组载体共转染HepG2和SMCC7721两种肝癌细胞系。实验结果显示,在加入不同浓度的Pre-mir-122后,与含有“TTCA”插入型等位基因的载体比较,含有“TTCA”缺失型等位基因载体的荧光强度显著下降,并呈现梯度依赖趋势。就miR-378而言,当Pre-mir-378浓度加大到10pmol以上时,我们观察到了同样的变化趋势,但rs3783553对miR-378与靶序列的结合的影响较miR-122小。(4)Taqman荧光定量PCR方法对不同rs3783553基因型肝癌组织样本的IL-1αmRNA表达水平进行比较后发现,4N Ins/4N Ins纯合子组的样本IL-1αmRNA表达水平最高,依次高于杂合子组和4N Del/4N Del纯合子组。26个4N Del/4N Del纯合子样本中有3个IL-1αmRNA表达水平未达到检测阈值,Ct按最大循环数40计算。非参数Mann–Whitney U检验显示三组间IL-1αmRNA表达水平存在显著性差异(P=0.042),其中4N Ins/4N Ins组和杂合子组IL-1αmRNA的表达水平分别是4N Del/4N Del组的5.57和3.76倍。 结论: (1)病例对照研究数据分析结果显示,位于IL1A-3′UTR的rs3783553与HCC易感性存在显著性关联,HBV分层后分析结果提示rs3783553多态可能在HBV感染的免疫调节过程中发挥作用,值得进一步深入研究;位于VEGF-5′UTR的rs35569394与HCC易感性未发现显著性关联;(2)根据体外及体内试验结果,我们初步阐明了rs3783553参与HCC发生的具体分子机制,即rs3783553位点“TTCA”四碱基插入破坏了miR-122与IL1A-3′UTR的紧密结合,使得miR-122对IL-1α转录后调控水平的抑制作用减弱,因此携带有“TTCA”插入型个体IL-1α的抗肿瘤免疫调控作用增强,进而使HCC易感性降低。(3)考虑到IL-1α不仅可以影响肿瘤发生、生长和侵润等病理过程,而且可以影响肿瘤与机体之间的相互作用,我们的实验结果提示IL-1α有望成为研究HCC发生机制、早期诊断以及免疫治疗的新靶点。


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