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1,25-(OH)_2D_3对1型糖尿病的防治作用及其机制研究

周正宇  
【摘要】: 糖尿病危害严重,与肿瘤、心血管疾病合称为威胁人类健康的三大杀手。近年来随着人类饮食结构的变化和人口的老龄化,世界糖尿病的发病率急剧升高。我国由于肥胖人群的增加,糖尿病的发病更是直线攀升,已经超过印度成为全球糖尿病患者最多的国家。维生素D具有多种效应,其在体内的活性代谢物1,25-(OH)2D3与靶细胞上的维生素D受体(vitamin D receptor,VDR)结合后,可发挥调节钙磷代谢、抗炎症、调控细胞有丝分裂、免疫调节和改善糖代谢等生物学功能。国内外的多项流行病学调查表明,维生素D可对糖尿病起到预防和治疗的作用,但其作用机制尚不明确。 目的:评价VDR基因敲除小鼠的生物学特性及其与糖尿病发生的关系;验证维生素D的活性代谢物1,25-(OH)2D3对1型糖尿病小鼠的防治作用,并探索1,25-(OH)2D3对1型糖尿病作用的分子机制,为糖尿病的防治和新药靶位的发现提供理论和实验依据。 方法:8~10周龄VDR基因敲除杂合子(VDR+/-)小鼠雌雄合笼,PCR法鉴定子代小鼠基因型,记录VDR基因敲除纯合子(VDR-/-)、VDR+/-和野生型(VDR+/+)数量,统计小鼠繁殖性能,绘制生长曲线;比较子代同窝VDR-/-、VDR+/-和VDR+/+小鼠脏器的重量和组织学形态差异以及血液生理生化指标的变化;将VDR-/-和VDR+/+小鼠分别尾静脉注射四氧嘧啶,用药后监测血糖和尿糖一个月,统计糖尿病的发生率;为研究1,25-(OH)2D3对1型糖尿病的预防作用,健康小鼠以2μg/kg隔日腹腔注射1,25-(OH)2D3持续两周后,用小剂量链脲佐菌素(STZ)连续多日注射法建立C57BL/6J小鼠1型糖尿病模型,比较1,25-(OH)2D3干预与否糖尿病的发病率;分别用1,25-(OH)2D3和雷帕霉素(RAPA)处理糖尿病小鼠,监测小鼠血糖、体重、进食量和饮水量,用病理切片和超薄切片观察小鼠脏器的病理变化以及凋亡和自噬的发生,免疫组化法检测VDR以及自噬和凋亡相关蛋白Beclin-1、Caspase-3的表达量,流式细胞术测定脾脏Th1/Th2分群和调节性T细胞(Treg)的数量;将具有胰岛β细胞生理特性的小鼠胰岛素瘤细胞株MIN6培养至对数生长期,研究1,25(OH)2D3对STZ所致细胞破坏的干预作用: ELISA法测定细胞胰岛素的分泌量,MTT法测定细胞活力,流式细胞术测定细胞凋亡率,Western Blot检测Beclin-1和Bcl-2蛋白的表达。 结果: 1. VDR+/-小鼠的平均妊娠期为22.5±1.78天,后代中VDR-/-出现的几率仅为5%(8/165);VDR-/-小鼠的体重和主要脏器的重量与同窝野生型和杂合子无明显差异,但其肝脏、肾脏和脾脏有炎症细胞浸润、空泡变性等病变;VDR-/-小鼠的白细胞、谷丙转氨酶、甘油三酯、肌酸激酶、乳酸脱氢酶等明显升高,钙、磷含量明显降低;四氧嘧啶作用后1周,VDR-/-小鼠的血糖均高于16.7 mmol/L,而野生型小鼠直到第3周只有50%的血糖高于阈值。 2.正常小鼠末次注射STZ后1周,血糖均≥16.7 mmol/L,预先注射1,25-(OH)2D3再用STZ处理的小鼠,其糖尿病的发病率显著降低,末次注射STZ后2周,仅66.7%的小鼠血糖高于阈值。糖尿病组小鼠体重持续降低,饮食、饮水量以及随机血糖持续增加,胰腺和肾脏有炎症细胞浸润,而用1,25-(OH)2D3治疗14天后,小鼠的血糖降低,脏器VDR的表达量增加,病变减轻,其他生物学特性也有一定程度的改善。 3.电镜下超微结构观察表明,糖尿病小鼠胰腺、肾脏、脾脏和胸腺均有明显病变,可见线粒体肿胀、粗面内质网扩张和染色质边集等现象,用1,25-(OH)2D3治疗后脾脏和胸腺凋亡的淋巴细胞增多,胰腺和肾脏的超微结构好转,且胰腺腺泡细胞和导管细胞内可见到自噬泡;免疫组化显示1,25-(OH)2D3处理后胰腺自噬蛋白Beclin-1的表达量升高,而凋亡蛋白Caspase-3的表达量降低;各组小鼠T淋巴细胞亚群的分析表明1,25-(OH)2D3可降低小鼠脾脏中的Th1细胞,上调Th2和CD4+CD25+ Treg细胞。糖尿病小鼠被雷帕霉素作用后症状和脏器病变进一步加重。MIN6细胞实验表明1,25-(OH)2D3预先干预,可促进STZ作用的MIN6细胞胰岛素的分泌,并降低其凋亡率,提高Beclin-1和Bcl-2蛋白的表达量。 结论 1. VDR基因敲除对后代的生长发育无明显影响,但可引起炎症、脏器功能和代谢的异常,使糖尿病发病率显著升高,证实维生素D缺乏在糖尿病的发生中起重要的作用。 2. 1,25-(OH)2D3预处理可降低模型动物糖尿病的发生率,对已发生的糖尿病有一定的治疗作用,可作为糖尿病防治的备选配伍药物。 3. 1,25-(OH)2D3通过下述途径影响1型糖尿病的进程。首先,1,25-(OH)2D3可诱导胰腺细胞发生一定程度的自噬,通过清除凋亡因子或衰老的细胞器实现自我修复,从而增加胰岛素的分泌量;其次,1,25-(OH)2D3可促进淋巴细胞凋亡,减少其对胰岛的免疫攻击;1,25-(OH)2D3还能降低Th1细胞、上调Th2和Treg细胞,诱导免疫耐受;此外,1,25-(OH)2D3可抑制炎症反应的程度,从而减轻糖尿病的症状。


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