收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

重组人源抗-CTGF scFv二聚体在ASM细胞增殖及化疗药物引起肺纤维化作用中的研究

高维  
【摘要】:化疗药物引起的肺纤维化,是一种不可逆性肺间质损伤,以肺组织中成纤维细胞的异常增殖、细胞外基质的过度沉积、弥漫性或局限性成纤维细胞灶的形成为主要病理特征,传统药物治疗效果差。结缔组织生长因子(connective tissue growth factor, CTGF)是转化因子-β(transforming growth factor-β, TGF-β)下游效应因子,具有介导细胞增殖迁移、诱导细胞转分化、促进ECM的产生等多种生物学功能,是导致肺纤维的主要关键性因子,阻断CTGF的表达可能为肺纤维化的治疗新的靶点。第一章重组人源抗-CTGF单链抗体二聚体的制备目的:制备纯度较高、具有生物学活性的抗-CTGF单链抗体二聚体。方法:1.构建pET28a-scFv-matrilin表达质粒;2.将质粒转化到E.coli.BL21(DE3)细胞中,IPTG诱导表达,经镍柱纯化得到抗-CTGF单链抗体二聚体;3.通过SDS-PAGE、Native-PAGE电泳和蛋白分子杂交进行蛋白及纯度鉴定;4. ELISA法检验其免疫学活性。结果:1. IPTG诱导后目的蛋白的表达量显著增加,为可溶性表达;2.经SDS-PAGE、Native-PAGE电泳和免疫印迹证实分离纯化得到的融合蛋白为二聚体,纯化后纯度在90%以上;3. scFv二聚体对CTGF具有较好的免疫学活性。结论:我们通过可溶性表达制备了纯度较高,具有较好免疫学活性的抗-CTGF单链抗体二聚体。第二章 重组人源抗-CTGF单链抗体二聚体对人气管平滑肌细胞增殖作用的影响及其机制研究目的:研究抗-CTGF单链抗体二聚体对CTGF诱导的气管平滑肌细胞(ASM)增殖作用的影响及其机制。方法:1.以不同浓度的CTGF (0、5、10、20、30、40、50ng/ml)刺激体外培养的ASM细胞1天、3天和5天,通过MTT检测ASM细胞的增殖能力;2.选取20 ng/ml的CTGF作用3天为药物诱导条件,MTT法检测scFv单链抗体或二聚体、抗CTGF单抗、以及通路抑制剂LY294002对CTGF诱导的ASM细胞增殖活性的影响;3. Western blot分别检测空白组、CTGF组、scFv二聚体组、抗-CTGF单克隆抗体组和通路抑制剂LY294002组细胞中p-Akt和p-mTOR蛋白表达水平。结果:1.20 ng/ml的CTGF作用3天能够显著诱导ASM细胞增殖(P0.05);2.scFv二聚体能够抑制CTGF诱导ASM细胞的增殖效应(P0.05); 3. CTGF诱导的ASM细胞Akt和mTOR蛋白的磷酸化程度升高(P0.05),加入scFv二聚体、抗-CTGF mAb和LY294002干预后,p-Akt和p-mTOR蛋白的表达量显著降低;结论:scFv二聚体能够抑制CTGF诱导的气管平滑肌细胞的增殖效应;scFv三聚体通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路的活性来抑制CTGF诱导的ASM细胞增殖。第三章重组人源抗-CTGF单链抗体二聚体在CTGF诱导的肺成纤维细胞转分化中的作用目的:探讨抗-CTGF单链抗体二聚体在CTGF诱导的肺成纤维细胞转分化中的作用。方法:1.分别采用0、10、20、30、40、50、60 ng/ml的CTGF刺激体外培养的HLEF细胞12 h、24 h和36 h, CCK8检测HLEF细胞的增殖能力;2.选取50 ng/ml的CTGF作用12 h为诱导条件,CCK8法检测scFv二聚体对CTGF诱导的HLEF细胞增殖活性的影响;3. RT-PCR分别检测CTGF诱导后CTGF组、scFv单链抗体组、scFv二聚体组、抗CTGF单克隆抗体组HLEF细胞中α-SMA和FNmRNA的转录水平;4. Western Blot检测scFv二聚体对以上各组HLEF细胞中α-SMA蛋白表达水平的影响。结果:1.50 ng/ml的CTGF作用12 h能够显著诱导ASM细胞增殖(P0.05);2.scFv二聚体能够抑制CTGF诱导的HLEF细胞的增殖效应(P0.05);3.CTGF诱导后HLEF细胞中α-SMA和FN mRNA的转录水平显著升高(P0.05),加入scFv二聚体和抗CTGF mAb干预后,α-SMA和FN mRNA的转录水平明显下调(P0.05), scFv单链效果弱于二聚体;4. CTGF诱导后HLEF细胞中α-SMA蛋白表达量显著增多(P0.05),加入scFv二聚体和抗CTGF mAb干预后α-SMA蛋白表达量明显降低(P0.05), scFv单链抗体的效果同样弱于二聚体组。结论:scFv二聚体可以通过下调a-SMA蛋白从而抑制CTGF诱导的肺成纤维细胞HLEF细胞向肌成纤维细胞的表型转化。第四章重组人源抗-CTGF单链抗体二聚体在化疗药物引起肺纤维化作用中的研究目的:探讨scFv二聚体在抑制肺纤维化中的作用及相关机制。方法:1.气管内滴注博莱霉素构建小鼠肺纤维化模型,尾静脉注射抗-CTGF scFv单链抗体和scFv二聚体进行干预。实验分为四组:A组(NS+NS组)、B组(BLM+NS组)、C组(BLM+scFv单链抗体组)和D组(BLM+scFv二聚体组);2.分别收集造模后第7天、14天和28天时小鼠肺组织支气管肺泡灌洗液,进行细胞计数和分类计数;3.观察第7天、14天和28天的小鼠肺组织羟脯氨酸和TGF-β1含量的动态变化;4.各组小鼠肺组织进行HE染色与Masson染色观察肺泡炎和肺纤维化程度并评分;5. RT-PCR分别检测各组肺纤维化小鼠肺组织CTGF和α-SMA mRNA转录水平;6. Western blot分析各组小鼠肺组织中P13K蛋白表达、Akt蛋白和mTOR蛋白磷酸化程度的差异。结果:1.成功构建小鼠肺纤维化模型;2.BLM组小鼠BALF中的细胞总数显著高于其它各组(P0.05),以中性粒细胞、淋巴细胞和巨噬细胞增多为主(P0.05),嗜酸性细胞未见明显增加(P0.05),BLM+scFv单链抗体组次之,BLM+scFv二聚体组BALF细胞计数和分类计数均明显低于单链抗体组(P0.05);3.肺病理切片HE染色和Masson染色显示BLM+scFv二聚体组肺泡炎和纤维化程度较BLM组和BLM+scFv单链抗体组降低(P0.05);4.BLM+scFv二聚体组小鼠肺组织羟脯氨酸和TGF-β1的含量显著降低(P0.05);5.BLM组小鼠肺组织中CTGF和α-SMA mRNA的转录水平最高,BLM+scFv二聚体组的转录水平显著降低(P0.05);6.BLM组P13K蛋白表达量显著增加(P0.05),Akt和mTOR蛋白的磷酸化程度最高(P0.05),BLM+scFv二聚体组的P13K.p-Akt和p-mTOR蛋白的表达量均显著降低(P0.05)。结论:抗-CTGF scFv二聚体可能通过抑制P13K/Akt/mTOR信号通路减轻博莱霉素诱导的小鼠肺纤维化。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 ;Expression and bioactivity identification of soluble MG_7 scFv[J];World Journal of Gastroenterology;2002年01期
2 钟小林,高会广,吉清,黄刚;一种可溶性单抗ScFv片段的表达及鉴定[J];第三军医大学学报;2003年08期
3 刘静;肖代雯;周小鸥;文雪;代红;王志华;沈昕;代维;杨道锋;沈关心;;Preparation and Identification of scFv and bsFv against Transferrin Receptor[J];Journal of Huazhong University of Science and Technology(Medical Sciences);2008年06期
4 马巍娜;贾雷立;刘雪林;宋宏彬;高志贤;钟彦伟;张传福;徐元勇;;抗盐酸克伦特罗人源ScFv抗体筛选与鉴定[J];中国公共卫生;2009年03期
5 胡川闽;李鹏;陈安;郭建秀;刘彦仿;;抗人肝癌单链抗体HAb25-scFv的构建及其表达[J];免疫学杂志;2005年06期
6 夏劲松;毕昊;姚琴;屈伸;宗义强;;Construction of Human ScFv Phage Display Library against Ovarian Tumor[J];华中科技大学学报(医学英德文版);2006年05期
7 管海宏,付萌,李巍,夏汝山,王刚,刘玉峰;天然抗角蛋白单克隆抗体3B4的噬菌体呈现的scFv的构建及表达[J];细胞与分子免疫学杂志;2005年04期
8 唐彩华;肖锡宾;吴涛;梁昌盛;刘长征;;BAC_5-scFv的表达、复性及活性检测[J];细胞与分子免疫学杂志;2006年01期
9 秦娜;;丙溴磷人源ScFv抗体的筛选与鉴定[J];太原师范学院学报(自然科学版);2008年02期
10 刘春雨;崔恒;昌晓红;叶雪;付天云;程洪艳;张果;熊英;成夜霞;张丽;赵旸;;6B11ScFv-mHSP70融合蛋白诱导抗卵巢癌免疫应答的体外实验研究[J];中国妇产科临床杂志;2008年04期
11 ;The Expression and Characterization of a Bifunctional Protein in E.coli for Autologous Erythrocyte Agglutination Test[J];Cellular & Molecular Immunology;2008年04期
12 武国军,郝晓柯,王禾,白玉杰,张盈华,药立波,范金水;Construction and expression of the single-chain Fv gene specific for humanγ-seminoprotein[J];Journal of Medical Colleges of PLA;1999年04期
13 ;Human scFv antibody fragments specific for hepatocellular carcinoma selected from a phage display library[J];World Journal of Gastroenterology;2005年26期
14 ;Humoral immune responses induced by anti-idiotypic antibody fusion protein of 6B11scFv/hGM-CSF in BALB/c mice[J];Chinese Medical Journal;2006年02期
15 邵晓枫;高灜岱;刘娟妮;王金宏;许元富;范冬梅;杨纯正;熊冬生;;抗抗CD3 ScFv单克隆抗体的制备和活性检测[J];中国医学科学院学报;2008年03期
16 尹惠琼,范泉水,谭德勇,王双印,孙阳,李刚山,邱薇,余敏;抗五步蛇毒ScFv噬菌体显示文库的构建及表达[J];中国免疫学杂志;2004年05期
17 ;Binding Activity Difference of Anti-CD20 scFv-Fc Fusion Protein Derived from Variable Domain Exchange[J];Cellular & Molecular Immunology;2006年06期
18 尹成凯;徐黎明;任桂萍;张巧;刘向宇;田辉;李德山;;酵母展示筛选scFv方法的建立[J];细胞与分子免疫学杂志;2009年12期
19 ;Antitumor effects of an engineered and energized fusion protein consisting of an anti-CD20 scFv fragment and lidamycin[J];Science China(Life Sciences);2011年03期
20 ;Generation and Characterization of C305,a Murine Neutralizing scFv Antibody That Can Inhibit BLyS Binding to Its Receptor BCMA[J];Acta Biochimica et Biophysica Sinica;2005年06期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 ;Preparation of Anti-Fumonisin B_1 Single Chain Antibody Fragment(scFv)and Establishment of Detection System for Fumonisin B_1[A];第九届中国生物毒素学术研讨会论文摘要[C];2009年
2 ;Construction,Expression and Activity Identification of anti-LMP1scFv/tP Fusion Protein[A];2008年全国生物化学与分子生物学学术大会论文摘要[C];2008年
3 ;Construction of mouse scFv phage display library against tetrodotoxin and Establishment of TTX's Detection System[A];第九届中国生物毒素学术研讨会论文摘要[C];2009年
4 ;Construction of Fusion Protein scFv-PhoA for the Immunodetection of DON[A];2005全国第二届核酸疫苗研讨会论文集[C];2005年
5 汤正好;余永胜;江红;奚敏;臧国庆;;非复制型腺病毒介导抗HBc ScFv细胞内表达和鉴定[A];中华医学会第十二次全国病毒性肝炎及肝病学术会议论文汇编[C];2005年
6 尹继刚;张西臣;李建华;朱平;柳增善;杨举;张国利;;抗隐孢子虫ScFv-PE40重组毒素表达质粒的构建及其在大肠杆菌中的表达[A];中国动物学会原生动物学分会第十二次学术讨论会论文摘要汇编[C];2003年
7 张果;崔恒;昌晓红;成夜霞;付天云;石菁菁;李巍;;重组6B11ScFv/Hsp70融合蛋白的构建、表达及活性测定[A];中华医学会第一届全球华人妇产科学术大会暨第三次全国妇产科中青年医师学术会议论文汇编[C];2007年
8 ;Construction of an Anti-human Melanoma Immunocytokine ScFv-mTNF-α and Study on its Anti-tumor Effects[A];2008年全国生物化学与分子生物学学术大会论文摘要[C];2008年
9 Zhujun Wang;Yuanyuan Chen;Sisi Li;Yuping Chen;Haizhao Zhao;Ming Jia;Zebin Luo;Yongmin Tang;;Successful construction and stable expression of an anti-CD45RA scFv-EGFP fusion protein in Chinese hamster ovary cells[A];2013年国家级“恶性血液系统疾病诊治新进展”学习班暨学术年会资料汇编[C];2013年
10 张玉静;高士争;刘松财;郝军元;;抗猪脂肪细胞特异膜蛋白scFv基因地克隆及序列分析[A];动物生理生化学分会第八次学术会议暨全国反刍动物营养生理生化第三次学术研讨会论文摘要汇编[C];2004年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 高维;重组人源抗-CTGF scFv二聚体在ASM细胞增殖及化疗药物引起肺纤维化作用中的研究[D];东南大学;2016年
2 郭军庆;免疫细胞因子IP10-scFv的构建及其抗肿瘤特性研究[D];武汉大学;2003年
3 张晓;全人源抗H5N1型禽流感病毒scFv广谱中和抗体的制备、鉴定及保守中和表位的分析[D];南京医科大学;2011年
4 李亮;抗Ⅳ型胶原酶单抗scFv片段与力达霉素构建的基因工程强化融合蛋白及其抗肿瘤作用的研究[D];中国协和医科大学;2003年
5 王柱军;靶向白血病干细胞新单抗3A4的人源化研究[D];浙江大学;2014年
6 王旋;双功能抗体融合蛋白IP10-scFv定向募集T淋巴细胞靶向治疗鼠脑恶性胶质瘤的研究[D];华中科技大学;2012年
7 石君帆;人源性噬菌体抗体库与rhG-CSF基因工程ScFv抗体的研究[D];浙江大学;2004年
8 刘俐伶;重组免疫毒素CD25scFv-α-luffin-KDEL的体外靶向生物学活性研究[D];第三军医大学;2010年
9 闫博;免疫促凋亡分子scFv15-Fdt-HA2-tBid的基因构建、表达及对HBsAg阳性肝细胞癌的杀伤作用[D];第四军医大学;2011年
10 朱志强;皖南尖吻蝮蛇毒素AaHIV,acucetin的结构功能研究及P185抗体ScFv-A21的结构生物学研究[D];中国科学技术大学;2009年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 于佳;产气荚膜梭菌α毒素表达、纯化及人源scFv抗体筛选[D];吉林农业大学;2015年
2 汤沁;胃癌单链抗体和免疫毒素scFv-TCS的制备和抗肿瘤作用研究[D];浙江大学;2014年
3 张珍珍;抗CD33单链抗体及免疫毒素scFv-Gz B的制备及活性检测[D];浙江大学;2014年
4 赵吉建;有机磷农药ScFv抗体的筛选研究[D];西北农林科技大学;2015年
5 吕欣欣;重组免疫毒素Gigantoxin-4-4D5 scFv的制备、体外活性研究及链接优化[D];华东理工大学;2016年
6 陈磊;人抗狂犬病毒小分子抗体ScFv-Fc在毕赤酵母中的表达与鉴定[D];吉林大学;2007年
7 赵杨;催化模块组装含硒单链抗体模拟GPx及活性研究[D];吉林大学;2012年
8 于颖;PRRSV GP5蛋白抗独特型单链抗体的构建表达与鉴定[D];山东农业大学;2011年
9 刘美云;从噬菌体抗体库中淘选B淋巴细胞刺激因子(BlyS)的中和抗体[D];暨南大学;2005年
10 陈晓旭;抗狂犬病毒G蛋白单链抗体scFv98H的纯化和复性工艺研究[D];吉林大学;2014年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978