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枸杞多糖的结构分析及代谢组学研究

唐华丽  
【摘要】:枸杞多糖(Lycium barbarum polysaccharide, LBP)是提取自我国药食两用中草药枸杞中的重要活性成分。药效学研究表明,LBP具有降低血糖等生物学效用。而与其药效学相比,LBP作为一种水溶性蛋白多糖,摄入后如何被消化吸收进入人体,在体内代谢生成何种物质从而发挥其功效作用等系列问题目前尚不清楚。因此,研究LBP等多糖类物质的结构特征、吸收与代谢过程,是进一步明确LBP等多糖功效发挥途径的关键。本文在课题组前期研究的基础上,对LBP的化学组成及基本结构进行了初步探讨;对其在大鼠体内的代谢动力学、组织分布及排泄进行了研究,初步阐明了LBP在大鼠体内的吸收、分布及排泄过程;同时采用代谢组学方法研究了给予LBP后大鼠体内代谢谱的变化,为LBP降糖作用机制研究提供新的思路,为深入研究和利用LBP等多糖类物质提供科学依据。主要研究工作如下:1.LBP的化学组成及结构分析采用温水浸提和膜分离法提取枸杞子中的LBP成分,样品经Sevage法脱蛋白、水透析以及冷冻干燥等处理,先后过DEAE离子交换柱和Sephadex凝胶柱层析纯化后得水溶性LBP亚组分LBP3。分别采用高效凝胶渗透色谱法(HPGPC)和PMP柱前衍生高效液相色谱法(PMP-HPLC)对LBP3进行分子量和单糖组成分析,结果显示LBP3的重均分子量(Mw)约为4.92 kDa;主要由D-甘露糖、L-鼠李糖、D-葡萄糖、D-半乳糖胺和D-木糖五种单糖残基组成,其摩尔比为5.52:5.11:28.06:1:1.70。在此基础上,分别采用紫外光谱(UV)、傅里叶红外光谱(FTIR)、核磁共振波谱(NMR)以及扫描电子显微镜(SEM)等表征手段对LBP3的结构和形态进行初步探讨,结果表明,LBP3为一蛋白多糖,分子结构中含有氨基或亚氨基基团,主要由α-D-吡喃糖残基构成,β-构型含量较低。综合上述分析,推测LBP3可能的直链结构有八种。2.LBP3的荧光标记及其标记物的稳定性研究LBP3属于多糖类物质,分子中既无发光基团,也无发色基团,不能直接利用紫外或荧光分析法进行检测,质谱法也不适合多糖的定量分析。因此,我们在前期实验和参考文献的基础上,结合LBP3的结构特点,对LBP3进行异硫氰酸酯荧光素(FITC)标记,得LBP3的荧光标记物LBP3-FITC。荧光光谱分析法检测标记后LBP3-FITC的荧光最大激发波长Ex和发射波长Em分别为495 nm和518 nm;标记物中FTIC含量为1.3%。对LBP3-FITC进行高效凝胶色谱分析表明,其分子量与标记前比较未发生显著变化。以LBP3-FITC为研究对象,分别采用高效凝胶色谱法和荧光光谱分析法考查LBP3-FITC在磷酸缓冲液(PBS),大鼠空白血浆、尿液以及酶溶液中的稳定性。结果显示,LBP3-FITC在体外PBS、大鼠血浆、尿液中经37℃,60 r/min条件下孵育0、1、6、12、24 h后,其分子量和荧光强度均未发生显著变化;LBP3-FITC在溶菌酶和α-淀粉酶溶液中经37℃,60 r/min条件下孵育2、6、12 h后取样检测也获得类似的结果。表明LBP3-FITC在体外PBS,大鼠血浆、尿液和酶溶液中能稳定存在。同时,考查LBP3-FITC经单次口服给予大鼠后在血浆、尿液和粪便中的稳定性,结果表明大鼠口服LBP3-FITC后2h内的血浆、6h内的尿液和粪便中LBP3-FITC未发生显著降解。说明大鼠口服LBP3-FITC后,主要以原型形式参与吸收和代谢。3. LBP3-FITC在大鼠体内的药代学研究实验首先建立了LBP3-FITC在大鼠血浆、尿液、粪便及组织中的荧光定量分析方法。结果表明,LBP3-FITC的荧光强度与大鼠血浆在0.2-20 μg/mL浓度范围内线性关系良好,LBP3-FTIC在低、中、高(0.2、2.0、20μg/mL)三种浓度下的日内精密度介于1.97%-7.28%之间,日间精密度介于2.62%-7.75%之间;血浆样品经室温放置24 h、反复冻融3次、-20℃下冻存15天处理后稳定性并未受到影响;LBP3-FITC在低、中、高三种浓度下组内加样回收率介于84.6%-104.0%之间,组间回收率介于98.3%-100.2%之间。此外,LBP3-FITC在大鼠尿液、粪便和组织中的线性、精密度、稳定性以及回收率分析均符合生物样品体内定量分析要求,表明本实验方法适用于LBP3-FITC在大鼠血浆、尿液等生物样品中含量的测定。利用LBP3-FITC在大鼠生物样品中的荧光定量分析方法对其在大鼠体内的代谢动力学进行研究。结果表明单次口服给予大鼠100、50、25 mg/kgLBP3-FITC后,LBP3-FITC的药-时曲线下面积AUC0-t分别为151.09±15.10,141.25±12.02,128.21±27.64mg/L.h; AUC(0-∞)分别为230.49±73.26,236.18±35.08,242.57±64.09 mg/L.h;最大峰浓度Cmax分别为7.44±0.72,6.56±0.51,5.27±0.44 mg/L;三种剂量下LBP3-FITC平均消除半衰期t1/2为38.41±9.55 h。表明LBP3-FITC在大鼠体内半衰期长,消除缓慢。大鼠单次口服给予LBP3-FITC后,组织分布实验表明,给药后1h, LBP3-FITC能分布到大部分组织中,在小肠和胃中分布较高,另外主要分布在肝脏、肾脏、大肠、心脏等组织;给药6h后,胃和小肠组织中LBP3-FITC浓度明显下降,肾脏、肝脏、大肠中LBP3-FITC浓度明显升高,表明LBP3-FITC吸收入血后主要经肾脏随尿液排出;给药24h后,大部分组织中LBP3-FITC浓度明显降低。大鼠经单次口服给予LBP3-FITC后,大鼠尿液和粪便中LBP3-FITC的累积排泄量分别为0.094±0.036%和92.18±3.609%,说明大鼠单次灌胃给予SD大鼠LBP3-FITC 后72h内,有相当于给药量92.274%的LBP3-FITC随尿液和粪便排出体外,而且主要从粪便中排出。表明LBP3在动物体内吸收率不高。4.LBP3在大鼠血清、尿液和肝脏中的代谢组学研究建立了适用于血清代谢物谱研究的气相色谱-飞行时间质谱(GC-TOFMS)技术并用于对照组(NC组)、2型糖尿病模型组(DM组)及枸杞多糖干预DM大鼠组(LBP3组)大鼠血清代谢物谱的分析。采用主成分分析(PCA)、正交偏最小二乘判别法(OPLS-DA)等模式识别方法对NC组、DM组及LBP3组大鼠血清代谢物谱进行分类并从血清中寻找与2型糖尿病相关的潜在生物标志物。所建立的方法能将三组大鼠血清代谢物谱分离,DM大鼠血清中丙氨酸、胸腺嘧啶脱氧核苷酸相对于NC组大鼠显著降低。LBP3干预DM组大鼠一个月后,LBP3干预组大鼠血清中丙氨酸、胸腺嘧啶核苷酸含量有所上升。血清中这两类物质可能与氨基酸代谢和核苷酸代谢有关,LBP3组大鼠与DM组大鼠血清中丙氨酸和胸腺嘧啶核苷酸水平的变化体现了体内氨基酸和核苷酸代谢的改变。建立了适用尿液代谢物谱研究的GC-TOF MS技术并用于NC组、DM组及LBP3组大鼠尿液代谢物谱的分析。采用PCA、OPLS-DA等模式识别方法对NC组、DM组及LBP3组大鼠尿液代谢物谱进行分类并从尿液中寻找与2型糖尿病相关的生物标志物。所建立的方法能将三组大鼠尿液代谢物谱很好区分,DM大鼠尿液中甲基丙二酸、苯甲酸、半乳糖醛酸水平明显升高而2,3-二羟基丁酸、嘌呤核苷明显降低。LBP3干预一个月后这些代谢物有向正常恢复的趋势。LBP3干预组和DM组大鼠尿液中甲基丙二酸、2,3-二羟基丁酸、嘌呤核苷、苯甲酸水平的变化提示可能存在氧化应激、氨基酸代谢、核苷酸代谢和肠道菌群的改变。建立了适用肝脏组织代谢物谱研究的GC-TOF MS技术并用于NC组、DM组及LBP3组大鼠肝脏代谢物谱的分析。采用PCA、OPLS-DA等模式识别方法对NC组、DM组及LBP3组大鼠肝脏代谢物谱进行分类并从肝脏组织中寻找与2型糖尿病相关的生物标志物。所建立的方法能将三组大鼠肝脏代谢物谱完全分开,DM大鼠肝脏中肌醇、羟基丁酸、泛酸水平显著降低而L-苹果酸、3,6-脱水-D-半乳糖、花生酸等水平显著升高,LBP3干预一个月后这些代谢物有向正常恢复的趋势。LBP3干预组和DM组大鼠肝脏中苹果酸、羟基丁酸、肌醇、花生酸水平的变化提示可能存在三羧酸循环、胰岛素敏感性和脂肪代谢的改变。结论:1.经柱层析纯化获得LBP亚组分LBP3主要由五种单糖残基组成,分子中含有氨基或亚氨基基团,初级结构主要由α-D-吡喃糖残基构成,β-构型含量较低。2.利用LBP3与FITC之间的共价偶联作用,成功将FITC标记在LBP3分子上,LBP3标记前后分子量未发生明显改变。标记物LBP3-FITC在动物体内外生物样品中显示出较好的稳定性。3.建立的LBP3-FITC荧光定量分析方法具有较高的精密度、稳定性和回收率,适用于LBP3-FITC在大鼠血浆、尿液等生物样品中含量的测定。4.大鼠单次口服给予LBP3-FITC后在动物体内半衰期长,消除缓慢。且给药1、6、24h后,随着时间的延长,LBP3-FITC不同组织中浓度变化明显,24 h后大部分组织中浓度显著降低。5.建立了适用于糖尿病大鼠血清、尿液和肝脏组织代谢物谱研究的GC-TOF MS技术,多元统计分析发现DM组大鼠血清、尿液和肝脏组织中众多代谢物浓度与NC组相比均发生了显著变化,提示可能存在氨基酸、核苷酸、三羧酸循环以及脂肪代谢和肠道菌群代谢的异常。经LBP3干预一个月后,DM大鼠血清、尿液和肝脏组织中相同的生物标记物向正常水平变化,从而有利于促进DM大鼠氨基酸、核苷酸、三羧酸循环以及脂肪代谢和肠道菌群代谢的恢复。本研究结果将有助于LBP后续降血糖机制以及开发利用研究。


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