HBx上调IncRNA UCA1参与肝细胞癌发生机制的研究

【摘要】：乙型肝炎病毒 X 蛋白(hepatitis B virus X protein,HBx)在 HBV(Hepatitis B virus,HBV)诱发的肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)中扮演着重要的角色。HBx介导肝癌发生的相关分子机制,尤其是表观遗传调控机制的充分阐明,有利于探索发现更多控制肝细胞癌的治疗方案与靶点。尽管近年的研究发现lncRNA(long non-coding RNA,lncRNA)分子具有多种生物学功能,然而人们对于lncRNA的认识依然十分有限。本研究的目的是探讨HBx对肝细胞lncRNA表达谱的影响,进一步研究HBx诱导的lncRNA分子的生物学功能及参与HCC发生的具体分子机制,更加全面的揭示HBx参与肝癌恶性转化的表观遗传调控机制。本研究首先应用 qPCR(Real-time Fluorescent Quantitative Reverse Transcriptase-polymerase Chain Reaction,qPCR)方法验证了前期 HBx 诱导的 lncRNA 差异表达谱中一些差异表达基因,筛选出HBx显著上调的lncRNA UCA1作为候选分子,进一步探究其在肝细胞癌发生中的作用及其机制。通过HBx转染和RNAi的方法检测了HBx对UCA1的调控作用,qPCR法检测了肝癌细胞系和临床病例组织中UCA1和HBx的表达水平,并分析二者表达水平的相关性。应用CCK-8细胞增殖实验、流式细胞术、平板克隆形成实验及裸鼠皮下成瘤实验等检测了 UCA1的生物学功能。Western blot法检测cleaved caspase 3、8、9的表达水平,分析UCA1对细胞凋亡相关蛋白的影响。qPCR及Western blot检测UCA1对可能的靶基因p27 mRNA和蛋白表达的影响。qPCR检测临床组织病例中p27的表达水平,并分析其与UCA1表达水平之间的相关性。采用RIP(RNA Immunoprecipitation,RIP)实验方法检测 UCA1 与 PRC2 亚单位 EZH2 的结合,ChIP(Chromatin Immunoprecipitation Assay,ChIP)实验分析 EZH2 与p27 启动子的区域的结合。RNAi干扰UCA1后,qPCR检测EZH2与p27启动子区结合的变化及结合后p27启动子区H3K27的三甲基化程度的变化。qPCR法检测正常肝脏组织、肝炎肝组织、肝癌癌旁及肝癌组织中UCA1的表达,分析UCA1的表达规律,探讨UCA1是否可能参与了“炎-癌”转化过程。预测与UCA1可能作用的miRNA并选取miR-122作为靶分子。qPCR检测UCA1表达降低对miR-122表达的影响。qPCR法检测miR-122在正常肝及肝炎组织中的表达,分析其表达与炎症的关系。特异性干扰UCA1后检测pri-miR-122表达的影响。qPCR法检测肝癌及癌旁组织miR-122及pri-miR-122的表达,并分析它们与UCA1表达水平间的相关性。分析miR-122 与人CCL2 3'UTR区匹配情况,以转染miR-122 mimics及inhibitors检测 miR-122对人CCL2表达的调节。慢性肝炎微环境下TGF-β信号通路常被激活,TGF-β处理永生化肝细胞系LO2探讨炎症微环境对UCA1表达的影响。通过以上研究获得如下结果:1)HBx显著上调lncRNA UCA1的表达,且UCA1的表达水平与HBx的诱导剂量相关;2)UCA1在肝癌病例组织中表达水平与HBx表达水平呈正相关关系;3)UCA1促进了肝癌细胞增殖,抑制了细胞凋亡并加速了细胞周期进程,促进小鼠体内致瘤性;4)肝癌细胞中过表达UCA1抑制了 p27的表达,肝癌组织中p27表达水平与UCA1呈负相关关系;5)UCA1影响了 EZH2在p27启动子处的结合,改变了此处H3K27的三甲基化程度。提示UCA1可能通过物理结合EZH2到p27启动子处实现对其表达的抑制;6)正常肝组织中几乎检测不到UCA1表达或仅存在较低水平的表达,而UCA1在肝炎及肝癌癌旁组织具有极高水平的表达;相对于邻近的癌旁组织,UCA1在肝癌组织表达水平显著下调;7)2例肝炎组织中miR-122的表达水平显著低于正常肝组织,21对肝癌及癌旁组织中UCA1与miR-122表达水平负相关。干扰UCA1显著上调miR-122表达;沉默内源性UCA1表达后,pri-miR-122的表达显著下调,并且临床组织中UCA1与pri-miR-122表达正相关。推测UCA1可能结合于pri-miR-122阻止miR-122成熟;8)下调miR-122促进了炎症反应相关分子CCL2表达,炎症因子TGF-β可以显著刺激肝细胞L02中UCA1的表达。综上所述,本研究发现lncRNA UCA1表达受HBx的调控,其表达变化与肝细胞癌的发生有关,首次揭示HBx-UCA1/EZH2-p27Kip1调控轴在肝癌发生中的作用,研究同时发现UCA1具有参与肝炎-肝癌的恶性转化的潜能。