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SET7/9介导E2F1甲基化途径调控肝细胞癌恶性表型及相关机制的研究

顾页  
【摘要】:研究背景与目的:肝细胞癌(HCC)是目前最常见的恶性肿瘤之一,也是癌症相关死亡的主要原因之一。肝细胞癌术后复发率高,转移迅速。此外,不适合手术的中晚期患者,化疗和放疗效果也欠佳。肝细胞癌的发病机制极其复杂,涉及遗传异常或表观遗传异常等多种因素。深入探讨肝细胞癌发生的分子基础有助于揭示肝细胞癌的致病机理,提供更好的治疗靶点与治疗方案,提高患者生存率。SET7/9是蛋白赖氨酸甲基转移酶(protein lysine methyltransferase)家族的成员,其编码基因位于人染色体4q28上,转录产生的mRNA全长7374 nt,CDS编码区长度为1098 nt,编码蛋白由366个氨基酸组成。SET7/9可催化组蛋白H3第四位赖氨酸(H3K4)和一些非组蛋白赖氨酸甲基化。这些非组蛋白包括转录因子、肿瘤抑制因子和表观遗传调控因子等。近年研究发现,蛋白赖氨酸甲基化是细胞内一种关键性翻译后修饰手段,可影响细胞生长、增殖和凋亡等生物学过程。人类不同肿瘤组织中常检测到SET7/9异常表达;SET7/9可负向或正向地调节其蛋白底物活性,引起与肿瘤发生、发展相关的多种细胞效应。本文主要观察肝细胞癌中SET7/9的表达情况,探讨SET7/9介导的非组蛋白甲基化调控肝细胞癌恶性表型的作用及机制。转录因子E2F1是E2F(E2 promoter-binding factor)家族成员,其编码基因位于人染色体20q11上,转录产生的mRNA全长2486 bp,编码蛋白由437个氨基酸组成。E2F1可调控多种基因表达,影响DNA合成、细胞周期和凋亡。E2F1过量表达既可驱使细胞进入S期,也可诱导细胞凋亡,其对细胞周期和凋亡的调控取决于其修饰类型和稳定性。E2F1肽链第185位赖氨酸甲基化修饰可抑制该蛋白乙酰化和磷酸化,促进其泛素化降解而抑制凋亡。E2F1起促凋亡作用时,经p53依赖性与p53非依赖性两种细胞信号通路活化下游Caspase-3、Caspase-9等促凋亡蛋白。因此,对于E2F1这种受SET7/9靶甲基化作用的非组蛋白,明确肝细胞癌细胞中SET7/9调节E2F1甲基化修饰变化的效应及机制是本文的重点内容。方法:本课题主要从临床病理分析、细胞功能实验与相关分子机制三方面对SET7/9介导的E2F1甲基化修饰对肝细胞癌恶性表型的调控作用及机制开展研究。1.人肝细胞癌组织中SET7/9表达状况与临床特征相关性分析采用免疫组化法检测入组的68例肝细胞癌组织与癌旁组织中SET7/9表达状况;统计分析SET7/9蛋白表达水平与病人年龄、性别、TNM分期、病理学分期等临床特征的关系。2.人肝细胞癌组织中E2F1表达状况与临床特征相关性分析采用免疫组化法检测入组的68例肝细胞癌组织与癌旁组织中E2F1表达状况,以及肝细胞癌组织标本中SET7/9与E2F1两者表达的相关性;统计分析E2F1蛋白表达水平与病人年龄、性别、TNM分期、病理学分期等临床特征的关系。3.SET7/9和E2F1在人肝细胞癌细胞中表达变化的细胞功能效应及其与甲基化修饰的相关性采用Western Blot法检测HepG2、Huh7、SMMC-7721和Bel-7404四种肝细胞癌细胞株和LO2正常肝细胞株中SET7/9与E2F1表达水平。选取合适的细胞株,采用SET7/9表达质粒或干扰表达质粒分别转染SET7/9低表达、高表达细胞株,构建SET7/9过表达细胞模型和干扰表达细胞模型。同时分别以转染空载质粒或scramble-shRNA质粒细胞株作为对照。通过Western Blot法检测转染前后SET7/9表达变化,确定转染效率。再采用CCK8法检测SET7/9过表达或干扰表达后细胞增殖能力;采用小室侵袭实验检测SET7/9过表达或干扰表达后细胞侵袭能力;采用划痕愈合实验检测SET7/9过表达或干扰表达后细胞迁移能力。选取合适细胞株,采用E2F1表达质粒或干扰表达质粒分别转染E2F1低表达、高表达细胞株,构建E2F1过表达细胞模型和干扰表达细胞模型。同时分别以转染空载质粒或scramble-shRNA质粒细胞株作为对照。通过Western Blot法检测质粒转染前后E2F1表达变化,确定转染效率。再采用CCK8法检测E2F1过表达或干扰表达后细胞增殖能力;采用小室侵袭实验检测E2F1过表达或干扰表达后细胞侵袭能力;采用划痕愈合实验检测E2F1过表达和干扰表达后细胞迁移能力。上述SET7/9与E2F1两者干扰表达实验结果均与蛋白甲基化抑制剂MTA(5'-deoxy-5'-methylthioadenosine)处理细胞结果进行比较,以反映前两者效应与蛋白分子甲基化修饰的关系。4.人肝细胞癌中SET7/9介导的甲基化作用对E2F1蛋白含量及E2F1下游靶分子的影响通过qRT-PCR和Western Blot分析检测SET7/9过表达或干扰表达前后E2F1mRNA表达变化与蛋白含量变化,以及E2F1过表达或干扰表达前后SET7/9 mRNA表达变化与蛋白含量变化,分析SET7/9与E2F1表达水平之间的调控关系以及与蛋白甲基化修饰的相关性。利用细胞浆核分离技术和免疫共沉淀法检测与分析SET7/9与E2F1蛋白的相互作用(互作)关系以及蛋白互作发生的细胞部位。查阅文献及公共数据库,找出E2F1下游的关键靶蛋白,通过Western Blot法检测SET7/9过表达与干扰表达后人肝细胞癌细胞内这些靶蛋白的表达变化以及与蛋白甲基化修饰的相关性,明确SET7/9介导的E2F1甲基化对下游信号通路分子的影响。5.统计学分析采用SPSS v20软件进行统计学检验。采用配对t检验比较人肝细胞癌组织和癌旁组织中SET7/9和E2F1表达水平,采用卡方(χ~2)检验分析人肝细胞癌组织中SET7/9和E2F1表达水平与临床病理特征之间的相关性,采用单因素方差分析(one-way analysis of variance,ANOVA)与Tukey’s post-hoc检验比较过表达、干扰表达或MTA处理细胞与对照细胞在细胞增殖、迁移和侵袭等方面能力差异的显著性,以P0.05为具有统计学意义。结果:1.SET7/9在人肝细胞癌组织中的表达与临床特征相关性分析免疫组化结果显示,68例临床肝细胞癌组织标本中,86.80%(59例/68例)标本中SET7/9蛋白水平增加或明显增加,SET7/9高表达率为77.94%(53例/68例)。统计学分析发现,肝细胞癌患者癌组织标本中SET7/9表达水平与年龄、性别、淋巴结转移和远端转移之间无相关性,但与肝细胞癌原发灶大小与范围(P0.05)以及病理分期(P0.05)有相关性。2.E2F1在人肝细胞癌组织中的表达与临床特征相关性分析免疫组化结果显示,68例临床肝细胞癌组织标本中,85.29%(58例/68例)标本中E2F1蛋白水平增加或明显增加,E2F1高表达率为64.71%(44例/68例)。统计学分析发现,肝细胞癌患者癌组织标本中E2F1表达水平与年龄、性别和远端转移之间无相关性,但与肝细胞癌原发灶大小与范围(P0.05)、淋巴结转移(P0.05)以及病理分期(P0.05)相关。入组肝细胞癌组织标本中,SET7/9与E2F1两者表达变化一致的比例为79.41%(54例/68例)。3.SET7/9、E2F1在人肝细胞癌细胞株中过表达或干扰表达后对细胞功能的影响及其与甲基化修饰的相关性Western Blot检测结果显示HepG2、Huh7、SMMC-7721和Bel-7404四株人肝细胞癌细胞SET7/9蛋白表达均高于LO2株人正常肝细胞中SET7/9蛋白水平,但程度有所不同,其中Bel-7404和HepG2细胞SET7/9水平相对较低,而Huh7和SMMC-7721细胞SET7/9水平相对较高;E2F1表达与SET7/9类似,Bel-7404与HepG2细胞E2F1表达较低,而Huh7和SMMC-7721细胞E2F1表达较高。结合SET7/9与E2F1在不同细胞株中表达水平和细胞培养的综合情况,本文选取Bel-7404细胞株进行后续过表达相关的实验研究,选取Huh7细胞株进行后续干扰表达相关的实验研究。对Bel-7404和Huh7两株人肝细胞癌细胞分别进行过表达或干扰表达处理,获得SET7/9过表达Bel-7404-SET7/9人肝细胞癌细胞株和SET7/9干扰表达Huh7-shRNA-SET7/9人肝细胞癌细胞株。通过Western Blot法检测过表达或干扰表达细胞中SET7/9表达水平,验证过表达和干扰表达效率。CCK8检测结果显示,与对照相比,Bel-7404-SET7/9细胞增殖能力升高(P0.05),而Huh7-shRNA-SET7/9细胞增殖能力降低(P0.05)。Transwell侵袭小室实验和划痕愈合实验结果表明,Bel-7404-SET7/9细胞侵袭和迁移能力增强(P0.05),而Huh7-shRNA-SET7/9细胞侵袭和迁移能力则降低(P0.05)。对Bel-7404和Huh7两株人肝细胞癌细胞分别进行过表达或干扰表达处理,获得E2F1过表达Bel-7404-E2F1人肝细胞癌细胞株和E2F1干扰表达Huh7-shRNA-E2F1人肝细胞癌细胞株。通过Western Blot法检测过表达或干扰表达细胞中E2F1表达水平,验证过表达和干扰表达效率。CCK8检测结果显示,与对照相比,Bel-7404-SET7/9细胞增殖能力升高(P0.05),而Huh7-shRNA-SET7/9细胞增殖能力则降低(P0.05)。Transwell侵袭小室实验和划痕愈合实验结果表明,Bel-7404-E2F1细胞体外侵袭和迁移能力增强(P0.05),而Huh7-shRNA-SET7/9细胞体外侵袭迁移能力则降低(P0.05)。上述SET7/9与E2F1两者干扰表达实验结果均与蛋白甲基化抑制剂MTA处理细胞结果相似,体现出前两者效应与蛋白分子甲基化修饰的相关性。4.人肝细胞癌中SET7/9介导的甲基化作用对E2F1蛋白含量及E2F1下游靶分子的调控作用Western Blot和qRT-PCR结果显示,人肝细胞癌中SET7/9过表达或干扰表达后,E2F1 mRNA表达并无显著变化,但蛋白含量却明显降低,这与经蛋白甲基化抑制剂MTA处理后细胞中E2F1 mRNA表达变化和蛋白含量变化一致。相反,人肝细胞癌中E2F1过表达或干扰表达后,SET7/9 mRNA与蛋白含量均无显著变化。免疫共沉淀分析显示SET7/9与E2F1在细胞质中具有直接的互作关系,而在细胞核中未见两者存在相互作用。Western Blot结果表明:SET7/9过表达细胞中E2F1及其下游关键靶蛋白因子cyclin E1、cyclin A2和CDK2蛋白含量均增加,而SET7/9干扰表达细胞中E2F1以及cyclin E1、cyclin A2和CDK2蛋白含量均降低。该SET7/9干扰表达实验结果与蛋白甲基化抑制剂MTA处理细胞结果相似,表明前者效应与蛋白分子甲基化修饰相关。结论:1.SET7/9在人肝细胞癌组织中高表达,且其表达水平与原发灶大小与范围以及病理分期显著相关。2.E2F1在人肝细胞癌组织中与SET7/9呈一致性高表达,且与原发灶大小与范围、淋巴结转移和病理分期显著相关。3.SET7/9通过调控E2F1翻译后甲基化状态促进人肝细胞癌细胞增殖、侵袭和转移。4.SET7/9介导的E2F1甲基化会改变E2F1含量及其下游靶蛋白分子E1、cyclin A2和CDK2表达水平,影响肝细胞癌细胞生物学行为。本研究创新之处:1.揭示了SET7/9和E2F1在人肝细胞癌临床标本中表达水平与相关性及临床意义;2.揭示了SET7/9和E2F1在人肝细胞癌细胞增殖、侵袭和迁移中的作用及其与蛋白甲基化修饰的相关性;3.揭示了SET7/9介导E2F1甲基化途径调控人肝细胞癌恶性表型的新机制。


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