环状RNA hsa_circ_0013958的筛选及其在肺腺癌中作用的研究

【摘要】：研究背景:肺癌是严重危害人类健康的第一大恶性肿瘤,其发病率和死亡率均居全球恶性肿瘤的首位。肺腺癌是肺癌中最常见的病理类型,其发病人数呈逐年增多趋势。肺腺癌早期在CT上表现为肺结节,然而病灶早期较小且多位于两肺的外周,给临床医生判断其良、恶性带来极大挑战。因此,积极寻找新型的分子标志物,对肺腺癌的早期诊断具有十分重要的临床意义。环状RNA(Circ RNA)具有组织特异性和疾病特异性,研究发现Circ RNA在多种肿瘤中具有特定的表达谱,因此Circ RNA具有成为肿瘤诊断标志物的潜力。研究目的:研究Circ RNA作为分子标志物对肺腺癌的诊断价值,并研究其在增殖、凋亡及侵袭转移等方面对肺腺癌的影响,进一步研究其吸附的mi RNA分子及可能的ce RNA机制,为肺腺癌的早期诊断提供新的思路。研究方法:(1)筛查和验证本研究首先应用Circ RNA芯片对3例确诊肺腺癌的组织标本进行分析,在高表达的Circ RNA分子中挑选出差异表达最明显的Circ RNA(hsa_circ_0013958),使用q PCR(Quantitative Polymerase Chain Reaction,q PCR)在多种肺腺癌细胞株、49例肺腺癌患者及30例肺腺癌患者血浆等标本中进行验证。(2)hsa_circ_0013958诊断效能分析采用ROC曲线分析hsa_circ_0013958作为诊断标志物在组织及血浆中的诊断价值。(3)hsa_circ_0013958对肺腺癌增殖、凋亡、侵袭的影响通过CCK-8实验和EDU实验检测hsa_circ_0013958对肺腺癌细胞增殖的影响,使用流式细胞仪检测hsa_circ_0013958对细胞凋亡的影响,Transwell实验检测hsa_circ_0013958对细胞迁移和侵袭的影响。裸鼠荷瘤实验从体内验证hsa_circ_0013958对肺腺癌的影响,对裸鼠的瘤组织进行免疫组化染色检测Ki67表达,并通过TUNEL法检测细胞凋亡比例。(4)内源性竞争性RNA(competing endogenous RNA,ce RNA)机制研究FISH(Fluorescence In Situ Hybridization)实验考察hsa_circ_0013958在肺腺癌细胞内的分布情况,通过生物信息学数据库分析hsa_circ_0013958可能的下游mi RNA及m RNA分子,进一步通过荧光素酶报告法和Western Blot进行验证。研究结果:(1)筛查和验证Circ RNA芯片共筛选出差异表达至2倍以上且有统计学差异的Circ RNA分子59种,其中相对正常组织高表达的39种,低表达的20种。其中,hsa_circ_0013958(hsa_circ RNA_100323)高表达最明显,因此选择它作为候选的Circ RNA进行验证。Northern Blot和PCR产物测序验证q PCR正确后,检测了7种肺腺癌细胞株,发现hsa_circ_0013958相对于正常细胞,在肺腺癌细胞中hsa_circ_0013958明显升高(P0.05)。检测了49例肺腺癌患者的癌组织及癌旁组织中circ_0013958的表达情况,结果显示,肺腺癌中hsa_circ_0013958高表达(P0.05)。为了明确hsa_circ_0013958在血浆中是否高表达,检测30例患者血浆标本,结果显示,30例中有27例高表达。(2)hsa_circ_0013958诊断效能分析对组织标本结果进行ROC分析,结果显示hsa_circ_0013958的总体ROC曲线的曲线下面积(AUC)是0.815(P0.001),以0.00101为cutoff值,敏感度和特异度分别为0.755和0.796;I期肺腺癌ROC的AUC是0.750(P0.001),敏感度和特异度分别为0.583和0.833;II期肺腺癌ROC的AUC是0.766,敏感度和特异度分别为0.813和0.750;III~IV期肺腺癌ROC的AUC为0.874,敏感度和特异度分别是0.762和0.857。血浆标本ROC曲线的AUC是0.794(P0.001),敏感度和特异度分别为0.667和0.933。(3)hsa_circ_0013958对肺腺癌增殖、凋亡、侵袭的影响hsa_circ_0013958对增殖的影响:CCK-8实验结果显示,肺腺癌细胞在敲低hsa_circ_0013958后细胞的OD450值较对照组明显下降(P0.01)。EDU实验显示在敲低hsa_circ_0013958后,处于增殖期的细胞比例明显减少(P0.01)。体内实验显示与对照组相比hsa_circ_0013958被敲低后能显著抑制肿瘤细胞的增殖(P0.001)。裸鼠肿瘤组织免疫组化结果显示,hsa_circ_0013958被敲低后组织的Ki67的表达量明显减少(P0.01)。hsa_circ_0013958对凋亡的影响:流式细胞术结果显示,hsa_circ_0013958被敲低后细胞的凋亡比例明显增加(P0.01)。对裸鼠荷瘤实验中的瘤组织进行TUNEL实验,结果显示,hsa_circ_0013958被敲低后细胞凋亡的比例明显增加(P0.01)。hsa_circ_0013958对侵袭的影响:Transwell实验显示hsa_circ_0013958被敲低后转移和侵袭的细胞数明显减少(P0.01)。(4)ce RNA机制研究在进行ce RNA机制研究之前,首先对hsa_circ_0013958进行细胞内定位分析。FISH结果显示它主要分布于胞浆中。生物信息学预测分析发现,有5个mi RNA分子分别为mi R-134、mi R-545、mi R-629、mi R-509、mi R-660,可能与hsa_circ_0013958结合。双荧光素酶报告法实验显示只有mi R-134能够与hsa_circ_0013958分子结合,而在非小细胞肺癌中CCND1是mi R-134下游的靶基因之一,据此推测可能存在circ_0013958/miR-134/CCND1通路。Western Blot实验证实了上述的推测。研究结论:(1)通过Circ RNA芯片筛选获得了在肺腺癌中差异表达的系列Circ RNA分子,在肺腺癌细胞、组织及血浆等标本中使用q PCR方法验证了hsa_circ_0013958高表达;(2)体内及体外实验均表明,hsa_circ_0013958具有促进肺腺癌细胞增殖、转移和侵袭的作用;同时,hsa_circ_0013958也具有抑制细胞凋亡的作用;(3)hsa_circ_0013958通过mi R-134影响CCND1蛋白而发挥促进细胞增殖等生物学功能;(4)hsa_circ_0013958具有成为肺腺癌早期诊断标志物的潜力。